《临床分离泛耐药菌的筛查及铜绿假单胞菌泛耐药机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
中图分类号R446．5UDC610硕士学位论文学校代码!Q5三3密级公珏临床分离泛耐药菌的筛查及铜绿假单胞菌泛耐药机制研究Screeningoffinicalisolatedpan’resistntScreeningoIclinicalisolatedpan-drugresistant‘1‘‘■o■nl-·‘strainSandinvestigationoloan-drugresistantmechanismsofPseudomonasaeruginosa作者姓名：李军学科专业：临床医学研究方向：临床检验诊断学学院(系、所)：湘雅医院指导教师：邹明祥副教授论文答辩日期巡．门答辩委贻拂盟中南大学湘雅医院二O一三年五月 原创性声明lIIIIIIIIIIIIIIIIIY2424510本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：乏查聋日期：j止年』月卑日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。日期：尘堕年』月望日 本课题受以下基金资助1．湖南省发改委研究基金：湖南地区临床主要泛耐药革兰阴性杆菌的流行病学及耐药机制研究。湘发改投资[20121305号。2．中南大学本科生自由探索研究创新基金：长沙地区产金属p．内酰胺酶铜绿假单胞菌的基因特征(ZYl1098) 临床分离泛耐药菌的筛查及铜绿假单胞菌泛耐药机制研究摘要目的：(1)Y解本院碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的临床分布、耐药特征及泛耐药现状。(2)探讨湖南地区临床分离泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)的主要耐药机制及分子流行病学特征。方法：(1)连续收集湘雅医院2011年9月1日．2012年6月30日临床分离非重复对碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌以及湖南地区15家医院2011年1月1日．2011年12月31日多重耐药铜绿假单胞菌。VITEK．2全自动微生物分析系统或API对病原菌进行鉴定；K．B法检测抗菌药物的敏感性、筛查泛耐药菌株；药敏结果以软件WHONET5．6进行分析。(2)对37株PDR-PA采用改良Hodge试验初筛碳青霉烯酶、双纸片协同试验和双纸片增效试验筛查金属p．内酰胺酶。(3)PCR坳I．[33种灭活酶基因(包括p．内酰胺酶基因、16SrRNA甲基化酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因等)、13种可移动性元件基因、3种外排泵基因以及外膜蛋白基因，并对扩增产物进行测序及BLAST分析。(4)琼脂对倍稀释法进行外排泵抑制剂的抑制试验，观察抗生素的MIC变化。实时荧光定量PCR检测外排泵基因MexA以及外膜蛋白基因OprD2的相对表达量。(5)脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)和聚类分析法进行菌株间同源性分析。结果：(1)205株碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌主要来源于呼吸道标本，占79．O％；科室分布以ICU(55．6％)为主。头孢哌酮／舒巴坦敏感率最高，为52．2％，对其他抗菌药物的耐药率达52．7％一100％，且监测到8株泛耐药鲍曼不动杆菌。(2)15家医院共分离到37株PDR-PA，改良Hodge实验阳性8株，阳性率为21．6％。金属p．内酰III 亟±堂僮论窒主塞擅墓胺酶初筛阳性5株，阳性率为13．5％。(3)37株PDR-PA中，其灭活酶基因阳性有TEM、armA、rmtB、VIM,IMP和CARB，阳性率分别是100．O％、22．O％、5．O％、19．O％、22．O％和37．8％。可移动性元件tnpU、tnp513、tnpA／tn21、merA和IntI等5种基因为阳性，阳性率分别为16．O％、81．O％、49．O％、100．O％和100．O％。所有阳性基因经BLAST分析证实，与Genbank中已知序列同源性均大于98．O％。(4)37株PDR-PA中，外排泵抑制试验阳性34株，阳性率为91．9％。对照组和实验组MexA基因的相对表达量分别为O．704-O．13以及1．95±O．48(P=0．018)，而OprD2基因的相对表达量分别为3．18±O．60以及O．94±O．08(e=-o．002)。(5)37株PDR-PA可分为21个型，A型最多，共5株。A1亚型同时出现在湘雅医院和湘雅三医院，E1亚型分别出现在湖南省第二人民医院和湘雅三医院。结论：(1)本院碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌呈严重的多重耐药性；(2)湖南地区已出现泛耐药鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌。(3)IMP、VIM、TEM、CARB、armA、rmtB等灭活酶以及外排泵MexAB．OprM的高表达和外膜蛋白OprD2的表达下降是导致本地区铜绿假单胞菌泛耐药的重要原因。(4)tnpU、tnp513、tnpA／tn21、merA和ImI等可移动性元件在耐药性传播方面发挥了重要作用。(5)本地区PDR-PA呈散发形式存在，但在不同医院以及同一医院不同病区之间有克隆传播。图23张，表18张，参考文献45篇。关键词：泛耐药；铜绿假单胞菌；耐药机制；分子流行病学分类号：R446．5IV Screeningofclinicalisolatedpan—drugresistantstrainsandinvestigationofpan—drugresistantmechanismsofAbstractPseudomonasaeruginosaObjective：(1)Tounderstandtheclinicaldistribution，antibioticsresistancecharacteristicsandpan-drugresistancestatusofcarbapenem-resistantA．baumannii(CR-AB)inourhospital．(2)Toinvestigatetheantibioticresistantmechanismsandmolecularepidemiologicalcharacteristicsofclinicalisolatedpan-drugresistantPaeruginosa(PDR-PA)inHunan．Methods：(1)Non—duplicatedclinicalisolatesofCR-ABinXiangyahospitalwerecollectedfromSeptember1，2011toJune30，2012．Whilenon-·duplicatedclinicalisolatesofpan·-drugresistantPaeruginosafrom15hospitalsinHunanareawerecollectedfromJanuary1，201toDecember31，2011．IdentificationofisolateswascarriedoutbyautomaticmicroorganismanalyticalsystemVitek-2orAPI．Antimicrobialsusceptibilitytestsandscreeningofpan—drugresistantstrainswereperformedbyKirby·BauermethodandthedatawereanalyzedbyWHONET5．6software．(2)ModifiedHodgetestwasusedforthescreeningofcarbapenemase．EDTA-synergytestandcombinationdiskdiffusionwereusedforphenotypicscreeningofmetallo-beta-lactamase(MBL)．(3)PCRwereperformedin37strainsofPDR-PAfortheV detectingof3inactivatedenzymegenes(includingthegenesofthe13-1actam，16SrRNAmethylaseandaminoglycosidemodifyingenzymes)，13movableelementsgenes，3effiuxpumpgenesandoutermembraneproteingenes．TheamplifiedproductsweresequencedandBLASTanalyseswereperformed．(4)MICsofantibioticcombinedwitheffiuxpumpinhibitors(CCCP)againstpan—drugresistantstrainsweredeterminedbyagardilutionmethod，andchangesofMICswereobserved．Real—TimePCRwasusedfordetectionoftheexpressionofeffiuxpumpgeneMexAandoutermembraneproteingeneOprD2．(5)HomologyofPDR-PAwasanalyzedbyPFGEandclusteranalysismethod．Results：(1)TwohundredandfivestrainsofCR-ABweremainlyisolatedfromrespiratorysamples(accountedfor79．O％)andICU(55．6％)wasthemaindepartment．Cefoperazone／sulbactamwithasensitiverateof52．2％wasthemostsensitiveantibioticstested，andtheresistantratetootherantibioticsrangedfrom52．7％to100％．Therewere8PDR-ABstrains．(2)EightstrainsshowedpositiveinmodifiedHodgetest，andthepositiveratewas21．6％．FivestrainsshowedpositiveinMBLscreeningtest，andthepositiveratewas13．5％．(3)Totally37strainsofPDR-PAwereisolatedfrom15hospitals．TheirinactivatedenzymegenesincludedTEM一1，armA，rmtB，VIM，IMPandCARB，withthepositiverateof100．O％，22．O％，5．O％，19．O％，22．O％and37．8％，respectively．Fivemovableelementsgenes，tnpU，tnp513，tnpA／tn21，merAandIntI，werepositive，withthepositiveratesof16．O％，81．O％，49．O％，100．O％and100．O％，respectively．AllthepositivegeneswereidentifiedbyBLASTVI analyze，andthesequencehomologywasallabove98．O％comparedwithknowngenesinGenbank．(4)Amongthe37PDR-PAstrains，34hadapositiveresultineffiuxpumpinhibittests，andthepositiveratewas91．9％．TherelativeexpressionlevelsofMexAgeneincontrolandexperimentalgroupwere0．70士0．13and1．95士0．48俨O．018)，respectively,whiletherelativeexpressionlevelsofOprD2geneincontrolandexperimentalgroupwere3．18士0．60and0．94土0．08俨O．002)，respectively．(5)Thirty—sevenPDR-PAstrainscouldbedividedinto21types，andtypeA(included5strains)wasthemaintype．SubtypeA1andE1appearedintwoteachinghospitalsatthesametime．Conclusions：(1)CR-ABinourhospitalpresentedwithseveremulti—drugresistance．(2)PDR-ABandPDR-PAwereemergedinHunanarea．(3)Produceofinactivatedenzymes，likeIMP,VIM，TEM．1，CARB，almAandrmtB，highexpressionofeffiUXpumpMexAB-OprM，anddecreasedexpressionofoutermembraneproteinOprD2werethemainmechanismsthatleadtothepan-drugresistanceofPAinthisarea．(4)Themovableelements，tnpU，tnp513，tnpA／tn21，merAandIntIplayedimportantrolesinthedisseminationofdrugresistance．(5)PrevalenceofPDR-PAinthisareawassporadic，buttherewereclonedisseminationsbetweendifferenthospitalsordifferentdepartmentswithinonehospital．Keywords：Pan-drugresistant；Pseudomonasaeruginosa；Resistancemechanism；MolecularepidemiologyClassification：R446．5VII 亟±堂焦论室目基目录原创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．I摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．IIIAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．V英汉缩写词对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．IX1绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．12湘雅医院碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的临床分布及耐药特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．32．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32．2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．52．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯73铜绿假单胞菌泛耐药机制研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．93．1灭活酶和可移动性元件检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯93．1．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯93．1．2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163．1．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．2外排泵和外膜蛋白分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．293．2．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．293．2．2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．323．2．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．354湖南地区泛耐药铜绿假单胞菌的分子流行病学研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯374．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．374．2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．384．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯415结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47攻读硕士学位期间研究成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．58致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯60VIII 英汉缩写词对照表IX 亟±堂僮i金塞!绪i金1绪论随着抗菌药物在临床上的广泛使用，细菌耐药现象日趋严重。近年来，临床分离病原菌中，多重耐药菌株比例不断上升，甚至出现了泛耐药菌株，给临床抗感染治疗带来了极大的挑战。泛耐药(Pan-drugresistant，PDR)菌是指对临床常用抗菌药物(除多粘菌素和／或替加环素之外)均耐药的病原菌，这些药物包括青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、B．内酰胺酶抑制剂复合药物、氨基糖苷类以及喹诺酮类等。近年来，泛耐药革兰阴性杆菌已在多个国家及地区报道，并且部分地区甚至出现暴发流行。据台湾的一项调查研究显示【lJ，泛耐药鲍曼不动杆菌已从1998年前的O．O％骤升到2000年的6．5％。随后，在希腊、法国、美国等畔1多个国家均有检出报道。CHlNET监测结果显示15J，我国临床分离鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及肺炎克雷伯菌均出现了泛耐药菌株，且有上升趋势。由于泛耐药菌株具有严重的耐药性，使得临床治疗极为困难。Falagas等【6J研究发现，泛耐药革兰阴性菌感染的死亡率为33．3％，而台湾的一项研究却高达60．0％f71。随着泛耐药菌株的出现，甚至流行，现已成为全球严重的公共卫生问题，引起了国内外学者的广泛关注。本课题组在日常工作中发现，临床常见泛耐药菌主要以非发酵菌为主。鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii，AB)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是临床分离率最高的两类非发酵菌，分别位居所有革兰阴性杆菌的第三和第四位，仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌【5，8】。由于这两类细菌广泛分布于自然界、医院环境及人体的皮肤等桫J。当机体免疫力低下时，可引起医院获得性肺炎、菌血症、术后伤口感染和泌尿系统感染等，是引起医院感染重要的病原菌【10】。为了解临床常见泛耐药菌的现状，本研究拟对这两类临床分离菌株进行筛查。碳青霉烯类抗生素(包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南等)是抗菌谱最广的一类p．内酰胺类抗生素，曾是治疗革兰阴性杆菌感染，尤其是鲍曼不动杆菌严重感染时的重要武器。然而，近年来，随着该类药物在临床上的广泛应用，国内外均有检出对其耐药的报道[11-131，且呈上升的趋势‘5，14，151。2010年卫生部全国细菌耐药监测网数据显示，我国临床分离鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南耐药率分别高达53．O％和53．3％t16j。由于碳青霉烯类抗生素抗菌活性强，一旦分离菌对其耐药则意味着对其他多种抗菌药物可能均耐药。为此，本研究通过对本院临床分离的耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌以及湖南地区15家医院常规工作中药敏结果显示严重耐药的铜绿假单胞菌，采用K．B法检测临床常用的抗菌药物敏感性，以筛查泛耐药菌株。 亟±堂焦论塞!绪论细菌耐药机制十分复杂，包括产生各种灭活酶(如KPC酶、金属酶、ESBLs、AmpC酶、16SrRNA甲基化酶基因、氨基糖苷类修饰酶等)、外排泵的过度表达、膜通透性降低、药物作用靶位的改变以及生物膜的形成等多种因素。希腊【r7】学者研究发现，产KPC．2的肺炎克雷伯菌同时检测到携带TEM．1、SHV．11、SHV．12、CTX．M．15和LEN．19等多种耐药基因。而Deplano等【2】的研究发现，染色体介导的AmpC酶、外膜蛋白OprD2的缺失和外排泵MexXY的高表达三种耐药机制同时存在并且相互影响。国内，沈继录等【18】在对临床分离的19株泛耐药菌株耐药机制的研究中发现，VEB．3型ESBL、aac(3)．II和ant(3”)．I氨基糖苷类钝化酶、DNA螺旋酶gyrA和拓扑异构酶ParC基因突变以及OprD2蛋白缺失和外排泵高表达等均参与其耐药。另有研究发现，耐药基因的分布情况存在地区差异，如金属酶中，IMP多见于东南亚国家，而VIM多见于南欧和东南亚。同时，耐药基因可以借助整合子、插入序列、接合性质粒以及转座子等可移动性元件水平传播，甚至导致耐药菌株的暴发性流行。如VIM在质粒的介导下可传播到肠杆菌科中的其它多个菌属和菌种，包括肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、大肠埃希菌等【19l。Goren等【20】研究发现，携带KPC．3的肺炎克雷伯菌可将其耐药基因通过质粒传播到大肠埃希菌。可见，多种耐药机制同时存在，并通过可移动元件进行传递，导致了细菌的广泛耐药及流行。为了解湖南地区临床分离泛耐药铜绿假单胞菌的主要耐药机制以及菌株之间的亲缘性，本研究采用分子生物学技术对湖南地区分离的37株泛耐药铜绿假单胞菌进行各种灭活酶基因(包括13．内酰胺酶基因、16SrRNA甲基化酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因等)、可移动性元件基因、外排泵以及外膜蛋白的表达情况检测；同时采用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)探讨其分子流行病学特征，以期为临床预防和控制泛耐药菌株的流行提供重要实验依据。 2湘雅医院碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的临床分布及耐药特征2．1材料和方法2．1．1实验菌株205株非重复碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌来源于2011年9月1日。2012年6月30日湘雅医院临床标本。所有实验菌株均经法国生物梅里埃公司VITEK-2全自动细菌鉴定／药敏分析系统进行鉴定。质控菌株大肠埃希菌(ATCC25922)和铜绿假单胞菌(ATCC27853)购自卫生部临床检验中心。改良Hodge试验标准菌株ATCCBAA．1705(阳性)和ATCCBAA-1706(阴性)由北京大学临床药理研究所李耘教授惠赠。2．1．2主要试剂和仪器哌拉西林(PRL)，哌拉西林／他唑巴坦(TZP)，四环素(TCY)，复方新诺明(SXT)，多西环素(DO)，米诺环素(MH)，氨苄西林／舒巴坦(SAM)，头孢噻肟(CTX)，头孢他啶(CAZ)，头孢吡肟(FEP)，妥布霉素(TOB)，亚胺培南(IPM)，美罗培南(MEM)，庆大霉素(CN)，阿米卡星(AK)，环丙沙星(CIP)，左氧氟沙星(LEV)，头孢哌酮／舒巴坦(SCF)，多粘菌素B(PB)等药敏纸片购自英国OXOID公司，MH琼脂购自杭州天和微生物试剂有限公司。VITEK．2全自动微生物鉴定分析系统及API试纸条购白法国梅里埃公司。2．1．3实验方法2．1．3．1碳青霉烯酶表型检测(改良Hodge试验)采用改良Hodge试验对CR-AB进行碳青霉烯酶的表型初筛，具体步骤如下：挑取过夜纯培养的大肠埃希菌ATCC25922(指示菌)，用生理盐水调制成0．5麦氏浊度的菌液后，将其用生理盐水按1：10稀释，用无菌棉签蘸取并涂布于MH平板上，待完全吸收后，在平板中间贴上厄他培南(10txg)，用接种环挑取单个待测菌或质控菌，并从平板中间离厄他培南5mm～10mm处向平板边缘划线，长度为20mm"-'25mm，35。C过夜培养。以肺炎克雷伯菌ATCCBAA．1705／1706作为质控菌株。结果判断：观察待测菌或质控菌划线与抑菌圈边缘交叉部分有无增强生长现象，若有则为阳性，反之，阴性。2．1．3．2药敏试验采用K．B法检测菌株对19种抗菌药物的敏感性。将临床收集的标本接种于相应的培养基上，35。C培养18"-'20h，根据菌落的形态、氧化酶试验及涂片镜检 的结果，取单个疑似菌菌落用全自动微生物分析系统VITEK．2和(或)API进行鉴定。经鉴定后的纯菌落以脱脂牛奶．80。C保存备用。菌株复苏，用接种环挑取35℃过夜培养的单个纯菌落，用生理盐水将其调成0．5麦氏浊度的菌液，用无菌棉签蘸取并均匀涂布于MH平板上，待菌液完全被吸收后，用分配器将药敏纸片贴于其上，35℃培养16"--18h后测量其抑菌圈的直径。每批次均用大肠埃希菌(ATCC25922)和铜绿假单胞菌(ATCC27853)作同步质控。2．1．3．3数据处理将患者资料及药物抑菌环直径输入WHONET5．6进行处理及分析，结果按2012年CLSIM100-$22有关不动杆菌的折点判定为敏感(S)、中介(I)或耐药(R)。判断标准见表2．1。表2-1鲍曼不动杆菌的抑菌圈直径判断折点注：“．”表示CLSI无判断折点。 2．2结果2．2．1标本来源205株碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌中，其标本来源以痰及支气管灌洗液等呼吸道标本为主，占79．0％，其次为创面分泌物(6．3％)和血液(3．9％)。结果见表2。2。表2-2205株碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌的标本分布2．2．2科室分布205株碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌以ICU所占比例最高，占55．6％，其次为神经外科(11．2％)和急诊科(4．4％)。结果见表2—3。 表2．3205株碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌的科室分布2．2．3碳青霉烯酶表型检测(改良Hodge试验)结果205株耐碳青霉烯类药物耐药(IPM或MEM至少1种耐药)鲍曼不动杆菌中，改良Hodge试验阳性27株(13．2呦，阴性178株(86．8呦。改良Hodge试验部分结果见图2—1。图2-1改良Hodge试验结果1：l‘fJ性对照；2：I‘EI性对照；3，4：临床样本。6 2．2．4药敏试验结果205株碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌中，亚胺培南和美罗培南的耐药模式有三种：亚胺培南和美罗培南均耐药，即IRMR有203株；亚胺培南中介且美罗培南耐药，即IIMR有1株；亚胺培南敏感而美罗培南耐药，即IsMR有1株。药敏结果显示，在被监测的19种抗菌药物中，敏感率最高的是头孢哌酮／舒巴坦(52．2％)，其余药物的敏感率均<28．0％。共检出8株泛耐药鲍曼不动杆菌。结果见表2．4。表2．4205株碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌对19种抗茵药物的敏感性(％)}：对于鲍曼不动杆菌，多粘菌素B没有K．B法药敏试验判断折点，监测中仅仅记录抑菌圈直径。2．3讨论鲍曼不动杆菌是院内感染的重要条件致病菌。在非发酵革兰阴性杆菌中，鲍 曼不动杆菌的临床分离率仅次于铜绿假单胞菌，且呈上升的趋势【211。该菌在医院环境中的分布广且可长期存活，所致感染部位十分广泛，包括呼吸系统、胸腹腔、伤口、血液、皮肤等，其中以呼吸系统最为常见【221。本次检测中发现，鲍曼不动杆菌的标本来源主要是痰及支气管灌洗液，与饶蓉等【23】的报道一致。205株碳青霉烯类药物耐药的鲍曼不动杆菌主要来自ICU，分析可能与ICU患者多接受插管治疗、长期使用过抗菌药物、住院时间长、多伴有基础性疾病等有关【24J。碳青霉烯类抗生素(包括亚胺培南、美罗培南等)是抗菌谱最广的一类p．内酰胺类抗生素，是治疗革兰阴性杆菌，尤其是鲍曼不动杆菌严重感染的重要药物。然而，随着该类药物在临床上的广泛应用，鲍曼不动杆菌对其耐药率不断增加，现已成为全球严重的公共卫生问题，引起了国内外学者的广泛关注【25。27J。据中国2011年CHINET细菌耐药监测网数据显示，我国住院患者分离的鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南耐药率分别为60．4％和61．4％，比2010年的敏感率下降了5．0％。本次监测共收集到205株碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌。改良Hodge显示阳性为27株(13．2％)，明显低于本课题组前期长沙地区的相关报道(61．7％1，【281，提示可能本院碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌耐药机制不以产生碳青霉烯酶为主，具体原因有待进一步研究。药敏结果显示，在被监测的19种抗菌药物中，敏感率最高的是头孢哌酮／舒巴坦(52．2％)，其余药物的敏感率均<28．0％。提示本院碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌耐药形势已十分严重，可供临床选用的治疗药物十分有限。本研究中共发现3种亚胺培南和美罗培南的耐药模式，包括IRMR203株，IIMR1株以及IsMR1株，以IRMR耐药模式为主。文献报道，亚胺培南敏感或中介而美罗培南耐药的现象较少见。本次监测中发现IIMR和IsMR各1株，其耐药机制有待进一步研究。泛耐药鲍曼不动杆菌(Pan-drugresistantA．baumannii，PDR．AB)已在世界上多个地区出现【29‘311。本研究共检出8株对所有监测药物均耐药(多粘菌素B除外)的PDR．AB。结合病史资料发现，这些病人大多来自ICU，且多伴有基础性疾病(包括高血压、糖尿病、慢性支气管炎、肺结核等)、经插入性治疗、多处损伤、年龄较大等。目前，对于泛耐药菌治疗有效的药物非常有限。多粘菌素曾因其肾毒性及神经毒性等原因而被迫暂停使用，近年来，因其对泛耐药菌株的治疗有效而被重新启用。然而，已有对其耐药的报道【3弱41，应引起高度警惕。可见，本院碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌呈严重的多重耐药性，且出现了泛耐药菌株。采取合理的措施预防和控制其暴发流行已势在必行。监测鲍曼不动杆菌的耐药性，了解其耐药性变迁，是一项长期的工作，对临床合理使用抗菌药物具有十分重要的指导意义。 亟±堂僮途塞三锢堡遐皇胞菌泛耐垫扭剑班究3铜绿假单胞菌泛耐药机制研究3．1灭活酶和可移动性元件检测3．1．1材料和方法3．1．1．1实验菌株收集湖南地区15家医院(湘雅医院、湘雅三医院、湖南省人民医院、湖南省第二人民医院、长沙市第一医院、长沙市第三医院、郴州市第一人民医院、益阳市中心医院、南华大学附属一医院、湘潭市中心医院、湘潭市第一人民医院、湘潭市第二人民医院、宁乡县人民医院、浏阳市人民医院、浏阳市中医院)2011年1月1日．2011年12月31日门诊及住院病人分离的铜绿假单胞菌。对这些医院经仪器或手工方法检测均耐药的菌株，进一步采用K．B法进行系统检测。检测药物包括哌拉西林、哌拉西林／他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、头孢噻肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、多粘菌素B、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、环丙沙星、左旋氧氟沙星、头孢哌酮／舒巴坦等共计15种。按2012年CLSIM100．$22有关铜绿假单胞菌的折点判定，除多粘菌素B外，其余全部耐药者为泛耐药铜绿假单胞菌(PDR．PA)。共计37株，来源于其中9家医院。具体分布见表3．1、表3．2、表3．3。表3．1泛耐药铜绿假单胞菌的菌株来源 亟±堂僮诠塞3塑堡偃整胞菌泛耐药扭剑研究表3．2泛耐药铜绿假单胞菌的科室分布表3-3泛耐药铜绿假单胞茵的标本来源质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603均购自卫生部临床检验中心，改良Hodge试验标准菌株ATCCBAA．1705(阳性)和ATCCBAA．1706(阴性)由北京大学临床药理研究所李耘教授惠赠。3．1．1．2主要试剂和仪器水解酪蛋白琼脂(MH)、所有药敏纸片均购自英国OXOID公司；0．5mmol／L的EDTA溶液为本室保存；2xTaqMasterMix、DNAMarker(D2000)等均购自北京百泰克生物技术有限公司；所有引物均由上海生工生物工程公司合成。VITEK．2全自动微生物分析系统(法国梅里埃生物公司)；ABl2720PCR扩增仪(美国ABI公司)；InGenius凝胶成像分析系统(英国Syngene公司)；DYY-7型电泳仪(北京六一仪器厂)；．80℃超低温冰箱(中国海尔集团)；高速冷冻离心机(Eppendorf公司)。 亟±堂焦途塞三锢堡遐皇胞菌泛耐荭扭盔』婴究3．1．1．3试剂及培养基配制①LB液体培养基：准确称量10．09胰化蛋白胨，5．09酵母提取物和10．09Nacl，量筒量取水1000mL，调PH值至7．4～7．6，121℃高压灭菌15min即可。②LB固体培养基：准确称量10．09胰化蛋白胨，5．09酵母提取物，10．09Nacl和15．09琼脂，量筒量取水1000mL，调PH值至7．4～7．6，121℃高压灭菌15min即可。③0．5MEDTA(PH8．0)：准确称量EDTA-Na2·2H20(分子量为372．24)186．19溶于800mL已灭菌的双蒸水中，NaOH调PH值至8．O，定容至1000mL，121℃高压灭菌。4。C保存。④含100}tg／mL叠氮钠的麦康凯培养基：准确称量16．59麦康凯干粉加入300mL蒸馏水中，盖好，放入高压锅中，121℃高压灭菌20min，待高压锅气压为零时将其拿出，待冷却至60。C左右时，然后准确称量30．0mg叠氮钠加入15mL无菌蒸馏水中完全溶解，之后，将其加入到麦康凯培养基中，摇匀，用移液管移取20mL加入到已消毒的平板中，待其冷却放入4。C冰箱备用。⑤0．25l-tg／mL美罗培南的麦康凯培养基：具体的步骤同④，准确称量75．099美罗培南溶于15mL二甲基亚砜(DMSO)。3．1．1．4引物原液浓度按上海生工生物工程公司说明配制成10btmol／L，-20。C冰箱保存备用。使用时用无菌去离子水10倍稀释。3．1．1．5碳青霉烯酶初筛采用改良I-Iodge试验具体步骤同2．1．3．1。3．1．1．6金属酶表型初筛IPM双纸片增效法取0．5此EDTA加于亚胺培南纸片，待完全吸收后，将含有EDTA及未含有EDTA的亚胺培南纸片贴于涂有待测菌的MH平板上，二者间距2．0cm--一3．0cm，35℃过夜培养。结果观察与判断：含有EDTA与未含有EDTA的亚胺培南纸片的抑菌直径相差>=6mm为阳性。EDTA．亚胺培南协同法挑取35℃过夜培养的单个待检菌菌落，用生理盐水调成O．5麦氏浊度菌液，涂布于MH平板上，待完全吸收后，吸取5此EDTA于已消毒的空白纸片，待完全吸收后，将亚胺培南纸片和已加EDTA的纸片贴于MH平板上，二者间距1．5cm'～2．0era，35。C过夜培养。结果观察：出现靠近EDTA侧抑菌圈增大者为阳性。3．1．1．7接合试验①以待检菌作为供体菌，受体菌为耐叠氮钠的E．coliJ53，并将二者分别接种于血琼脂平板上，35℃培养16--一18h。②次日，挑取单个供体菌和受体菌分别接种于5mL新鲜LB液体培养基中， 亟±堂僮论塞3塑堡偃望胞菌泛耐药扭剑研究37℃，180rpm，摇床16～18h。③第三天，各取供体菌和受体菌0．5mL分别接种于4．5mL新鲜LB液体培养基中，受体菌37。C，180rpm，摇床培养4h，而供体菌放入培养箱35。C静置培养4h。④取供体菌和受体菌各0．5mL同时加入4mL新鲜LB液体培养基中，放入培养箱35℃过夜培养。⑤第四天，取过夜培养的混合菌lmL放入无菌离心管中，2500rpm离心5min，用加样枪吸弃大部分上清液，至剩余100I．tL上清液并悬浮沉淀，将悬浮液均匀涂布于含有100I．tg／mL叠氮钠和0．2599／mL美罗培南的麦康凯培养基上，培养箱中35℃过夜培养。⑥第五天，挑取单个红色的菌落接种于同批次含药平板上连续传代3次，直至性状稳定。同时，对可疑的接合子进行生化鉴定、药敏分析及相关的耐药基因检测，以判断接合是否成功。3．1．1．8基因检测DNA提取待测菌株35。C过夜培养。用接种环挑取单个纯的菌落于装有1009L无菌双蒸水的EP管中，盖上盖子，95。C水浴10min，．20。C静置5min，4。C，5,0009，5min，上清液即为DNA模板，置于．20℃冰箱保存备用。PCR按表3．4中的引物序列合成引物，PCR反应体系(25“L)：12．59L2xTaqPCRMasterMix，DNA模板l此，上、下游引物各IIxL和无菌双蒸水9．5此。PCR反应条件：预变性94。C，5min，94。C变性30s_÷退火(目的片段
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