抗鸭瘟病毒活性物质的筛选及白藜芦醇抗鸭瘟病毒活性与作用机制研究

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1、万方数据本论文由“四川农业大学优秀博士论文培育基金(YB201304)"、“国家“十二五"农村领J，或国家科技计划课题防治畜禽病毒、抗菌感染中药成分方剂研制子课题“现代中兽药研究与新药创制"研究(201BAD34800)"资助万方数据lIllUlIIIIIIIIIIIIIlUIIIllq哪JO121351论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学

2、或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。。研究生签名：09f中年6月夕日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。、血苯论文不保密。口本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上口内划“√”

3、)研究生签名：导师签名：渊牛年l勿f中年√勿f中年B日甲／罗月台石万方数据中文摘要抗鸭瘟病毒活性物质的筛选及白藜芦醇抗鸭瘟病毒活性与作用机制研究博士研究生：徐娇指导老师：殷中琼教授贾仁勇教授疱疹病毒临床治疗药物以核苷酸类似物为主。该类药物作用靶点类似，容易导致交叉耐药性，目前临床已有耐药毒株出现。因此，发现新的靶点药物是未来研究疱疹病毒药物的重点。鸭瘟病毒(DuckPlagueVirus，DPV)是一种急性传染性病毒，该病毒属疱疹病毒科。目前，没有针对DPV的治疗药物出现，生产上以注射疫苗预防为主。本研究拟从天然药用产物

4、中筛选出具有抗DPV活性的物质，并对该物质抗病毒机制进行研究，希望能找到新的作用靶点，为鸭瘟的治疗提供新的方法，也为抗疱疹类病毒药物的开发提供新的靶点和思路。本研究分为以下几个部分：1体外抗DPV活性物质筛选选取多种天然药用产物，运用细胞病变法和噻唑蓝比色法相结合的方法，进行体外抗DPV研究。结果如下：①传统中药粗提物中，虎杖和茜草的醇提物具有一定的抗DPV活性：虎杖醇提物对DPV最高抑制率为76．5％；茜草醇提物对DPV最高抑制率为48．91％。②印楝种仁醇提物石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水层分对DPV的最高抑制率分

5、别为13．23％、29．24％和11．72％。③油樟挥发油及其主要活性成分中，松油烯．4．醇、0【一松油烯、Y．松油烯和1，8．桉叶素对DPV抑制率分别为4．42％、14．27％、25．33％和21．02％。由以上结果可知，所检测的多种天然药用产物中，虎杖醇提物抗DPV效果最好。2白藜芦醇体外抗DPV活性研究以虎杖中主要药用成分白藜芦醇作为研究对象，通过CPE、MTT法和滴度法检测了白藜芦醇体外抗DPV活性。结果如下：①利用CPE法观察白藜芦醇对DPV引起的鸭胚成纤维细胞(Duckembryofibroblasts，DE

6、Fs)病变的抑制作用。结果发现，当白藜芦醇浓度为3】．2599／mL，能够完全抑制细胞病变。②利用MTT法检测白藜芦醇对DPV的抑制作用。结果发现，白藜芦醇体外抗DPV的半数抑制浓度为3．85士0．08gg／mL，半数有毒浓度为61．07士0．24gg／mL，治疗指数为15．86。③通过滴度法检I万方数据中文摘要测白藜芦醇作用后DEFs中繁殖的DPV的滴度。结果发现，白藜芦醇能够显著降低病毒在●细胞内增殖后的滴度。由以上结果可知，白藜芦醇具有裒好的体外抗DPV活性。3TaqMan绝对荧光定量PCR方法的建立和自藜芦醇对I

7、)PV体外复制的影响以DPVUL30基因为目标片段，设计引物和TaqMan探针，建立荧光定量PCR方法，结果表明，该方法建立的标准曲线线性关系良好(R2=O．997)，扩增效率(E)为99．7‰且具有良好的特异性、敏感性和稳定性。利用该方法检测白藜芦醇对DPV在DEFs中的生长影响，结果如下：①病毒感染组：病毒粒子在感染DEFs8h时开始逐渐增多，到48h达到最高点。②自藜芦醇作用组：病毒粒子拷贝数24h内无明显增多，24h后病毒粒子拷贝数开始增长，增长速度显著低于病毒感染组(p<0．05)。以上结果表明，白藜芦醇能够延

8、长DPV在DEFs中的潜伏期，对该病毒在宿主细胞中的复制有明显的抑制作用。4白藜芦醇体外抗I)PV作用特征的研究通过不同方式用药、不同时间加药以及透射电镜等方法研究白藜芦醇体外抗DPV作用特征。结果如下：①以胞外直接杀灭、药物对细胞的保护、病毒穿入和病毒胞内繁殖四种方式，考察白藜芦醇体外抗DPV活性。利用己建立的Ta