角毛壳葡聚糖酶基因克隆和在毕赤酵母中表达

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1、ClassifiedIndex:Q933U.D.C:579DissertationfortheMasterDegreeinScienceCLONINGOFGLUCANASEGENEFROMChaetomiumcupreumandITSEXPRESSIONINPichiapastorisCandidate:WangXiaolongSupervisor:SongJinzhuAcademicDegreeAppliedfor:MasterofScienceSpecialty:BiologyAffiliation:SchoolofLifeScienceandTechnologyDateofDef

2、ence:July,2012Degree-Conferring-Institution:HarbinInstituteofTechnology摘要摘要中国是个农业大国，农药的用量巨大，且以化学农药为主。化学农药的长期使用会造成一系列的环境问题和食品安全问题，如易诱发抗药性，易产生剂量依赖，专一性差而破坏生态结构等。随着环保意识的提高，生物农药为此提供了行之有效而且绿色环保的解决方向。毛壳菌（Chaetomiumspp）是一类具有生防能力的真菌，可以用来做微生物源生物农药。它可产生降解植物病原真菌的细胞壁的几丁质酶和葡聚糖酶，结合其它一些机制来有效抑制植物病原真菌生长。本研究旨在找到角毛

3、壳菌的葡聚糖酶基因序列并测定其蛋白对植物病原菌的防治能力。从角毛壳菌基因组中克隆到葡聚糖酶基因cgc，全长1709bp，其中83bp-267bp是内含子序列。生物信息学方法分析表明此基因序列共编码541个氨基酸，前19氨基酸是信号肽序列，理论大小为55.6kDa。通过构建重组质粒+pPIC9K-cgc，电转化毕赤酵母GS115菌株中，筛选后得到4个Mut阳性转化子。诱导表达后得到目的蛋白在60kDa与100kDa之间。角毛壳重组葡聚糖酶蛋白最适温度约45℃，最适pH5.0，粗酶液酶活0.1283U，50%浓度下，对尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制率为11.8%，在植物病原菌生物防治研究上具有潜

4、在的理论和实践上的意义。关键词：角毛壳菌（Chaetomiumcupreum）；葡聚糖酶；生物防治；电转化；毕赤酵母；酶活；孢子萌发-I-AbstractAbstractChinaisavastagriculturalcountry,andhasaverybigpesticideconsumption,mostofwhichischemicalpesticides.Longapplicationofchemicalpesticidescancausemanyenvironmentalandfoodsafetyissues,suchasinducedresistance,dosedepe

5、ndentmanner,lowspecificitywhichmaydestroytheecosystemstructure,andsoon.Withtheincreaseoftheenvironmentalprotectionconsciousnessofpeople,biologicalpesticidesprovideaeffectiveandenvironmentalprotectivesolutiontosolvethoseproblems.Withtheabilityofbiologicalcontrol,Chaetomiumsppcanbeusedformicrobial

6、pesticides.Thisfungicangeneratetwoenzymeincludechitinaseandglucanasewhichcandegradethecellwallofplantpathogenicfungi,andinhibitthegrowthofplantpathogenicfungieffectivelywithothermechanisms.Chaetomiumcupreumisoneofthem.ThisstudyisdesignedtosearchforaglucanasegenefromChaetomiumcupreumandtestitsabi

7、litytopreventplantpathogenicfungi.AglucanasegenenamedcgcisfoundfromthegenomeofChaetomiumcupreum.Thisgeneis1709bp,andincludesoneintronfrom83bpto267bpandtwoextrons.Bioinformaticsanalysisshowsthatthisgenecanencode541aminoacidre