犬细小病毒vp2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达犬细小病毒vp2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达的论文

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　　犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达的论文【摘要】目的表达犬细小病毒vp2蛋白（cpvvp2），用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和vp2蛋白功能研究。方法采用pcr方法对cpvvp2基因进行扩增，将cpvvp2基因克隆到毕赤酵母(pichiapastoris)分泌表达载体ppiczαa中，构建真核重组表达载体ppiczαavp2，将该重组质粒线性化后，转化毕赤酵母菌gs115中，在甲醇诱导下表达cpvvp2，sdspage和ing2，caozhen2，edicineofchineseagricultureuniversity，beijing100094；2.nationalveterinarydiagnosticcenterofministryofagriculture，beijing100094，china)【abstract】objectivetoestablishayeastpichiapastorisexpressionsystemexpressingcanineparvovirusvp2protein(cpvvp2)toservethediagnosisofcpv，developmentofcpvvaccineandresearchofvp2proteinfunction.methodscpvvp2geneplifiedbypcr，clonedintosecretorypichiapastorisexpressionvectorppiczαa，andedppiczαavp2.afterbeinglinearizededigestion，thevectoredintopichiapastorisgs115byelectroporationmethod.thecpvvp2proteinexpressedethanolinduction.theexpressedproteininyeastplified，sdspageandagainstcpv.conclusioncpvvp2hasbeensuccessfullyexpressedinyeastpichiapastoris.theexpressedcpvvp2proteinsharesreactionagainstcpv.【key109感受态细胞购自promega公司，c表达载体ppiczαa、毕赤酵母gs115菌株及抗生素zeocintm购自invitrogen公司。1.1.2主要试剂、试剂盒及培养基：限制性内切酶ecorⅰ、xbaⅰ、sacⅰ、dnamaker购自大连宝生物技术有限公司；taqdnapolymerase、dntp、t4dna连接酶购自promega公司。小量胶回收试剂盒、酵母基因组dna提取试剂盒购自上海华舜生物工程公司，质粒纯化试剂盒购自博大泰克公司，低盐lb、ypd、mdh、mmh、bmgy、bmmy等培养基均按照invitrogen公司毕赤酵母表达说明书配制［2］。辣根过氧化酶标记羊抗犬酶标二抗购自中杉公司。1.1.2引物:根据已发表的cpv的vp2基因dna序列，利用primer5.0软件设计一对引物，上游引物中含有ecori限制性酶切位点，下游引物中含有xbai限制性酶切位点，重组表达质粒的pcr鉴定所用引物根据表达载体ppiczαa上的5′aox1和3′ aox1引物位点合成，引物由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列如下：上游引物vp2f：5′gcgaattcatgagtgatggagcagtt3′;下游引物vp2r：5′actctagatataattttctaggtgc3′;pcr鉴定引物：5′aox1：5′gactggttccaattgacaagc3′;3′aox1：5′gcaaatggcattctgacatcc3′;使用液浓度为10pmol/μl。1.2方法1.2.1cpvdna的提取：采用酚氯仿异戊醇方法提取病毒dna，沉淀用50μl双蒸水溶解，-20℃保存备用。1.2.2pcr扩增vp2基因：以上步提取的dna为模板，利用特异性引物vp2f/vp2r扩增vp2基因。pcr反应体系20μl：ddh2o8μl，10×pcrbuffer2μl，2.5mmol/ldntp2μl，15mmol/lmg2+2μl，10pmol/μl目的基因上下游引物混合液2μl，0.5u/μltaqdna聚合酶2μl，cpvdna模板2μl。反应条件为95℃预变性8min；94℃变性2min，54℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后，72℃延伸10min。95℃预变性8min后立即加入taqdna酶。pcr产物在1%琼脂糖凝胶中电泳。1.2.3表达载体ppiczαavp2的构建:以cpvdna为模板，用引物vp2f/vp2r进行pcr扩增获得cpvvp2基因片段。pcr扩增片段用ecori和xbai双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收后，将cpvvp2基因片段克隆入穿梭质粒ppiczαa的ecori和xbai酶切位点，并转化jm109感受态细胞。酶切、连接、转化及质粒dna的制备方法均按文献进行［3］。1.2.4重组表达质粒的pcr鉴定:反应体系为20μl，引物为5′aox1和3′aox1；反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃延伸10min。1.2.5重组表达质粒的酶切鉴定:用限制性内切酶ecorⅰ和xbaⅰ对ppiczαavp2重组表达质粒进行双酶切。1.2.6重组表达质粒的序列测定:重组表达质粒的序列测定由北京生物工程技术有限公司完成。1.2.7重组表达质粒转化毕赤酵母gs115:采用电穿孔法，制备毕赤酵母gs115感受态细胞［4］。将重组表达质粒ppiczαavp2用saci单酶切线性化后，用lifetechnologies电转仪在参数为2.5kv、25μf、200ω条件下进行电击，立即加入1ml预冷的1mol/l山梨醇混匀，29.5℃温箱温浴1h，将温浴后的产物涂布于含有100μg/mlzeocintmypds平板，于29.5℃温箱培养3～4d。1.2.8酵母转化子的表型筛选: 在mmh平板上与mdh平板上生长速度一致的重组子为甲醇利用正表型（mut+表型）；在mdh平板上生长速度快，而在mmh平板上生长速度慢的重组子为甲醇利用慢表型（muts表型）。将转化子进行表型筛选。1.2.9酵母转化子的pcr鉴定:挑取数个重组子，按酵母dna提取试剂盒说明书抽提酵母转化子基因组dna作为模板，进行pcr鉴定。1.2.10重组酵母菌株的表达及鉴定:1.2.10.1重组酵母菌株的表达:将筛选的阳性转化子接种到酵母菌100mlbmgy培养基中29.5℃，280r/min，振荡培养至菌液浓度a600值达3～6时，25℃、3000r/min，离心5min后收获菌体沉淀，用10mlbmmy重悬酵母菌体进行诱导表达。每隔12h取样并同时补加0.5%的甲醇和0.004%的组氨酸。1.2.10.2重组表达蛋白的sdspage分析:取培养液上清进行sdspage后，用考马斯亮蓝r250染色，并用紫外凝胶成像系统照相。1.2.10.3重组表达蛋白的my酵母培养基29.5℃摇瓶培养96h后，取上清进行sdspage分析。结果表明在64.35kd处出现目的蛋白条带（图4）。使用cpv阳性血清，对上述表达的蛋白产物进行蛋白印迹分析，结果在64.35kd处的特异性条带能与cpv病毒阳性血清发生特异性反应（图5）。说明表达的vp2蛋白具有良好的反应原性。3讨论酵母表达系统是用来表达复杂蛋白的一类较为理想的表达系统，在基因工程产品产业化生产中具有很好的商业前景。迄今，国内外已有很多外源蛋白表达成功的例子，如乙肝表面抗原、破伤风毒素片段c、肿瘤坏死因子（tnf）、人溶菌酶、胰岛素前体、图1acpvvp2基因的扩增与原核表达系统相比，本研究所用毕赤酵母表达系统表达的蛋白具有以下优点：1.表达的外源蛋白具有天然蛋白的生物活性；2.外源蛋白不形成包涵体，可直接分泌到胞外；3.自身分泌蛋白非常少，外源蛋白带有6his组氨酸标签，有利于重组蛋白的纯化。杨玲等［11］研究表明将cpvvp2基因克隆到pgex6p1载体中，经iptg诱导并不能获得目的蛋白表达，必须将全基因分段表达，但分段表达产物不具备vp2完整蛋白的生物学特性。国外学者研究表明，cpvvp2基因在真核表达系统杆状病毒中能成功获得表达。国内学者王玉玲等［12］利用真核表达系统杆状病毒成功构建了真核表达质粒pmelbaccvp2。本研究利用毕赤酵母pichiapastoris分泌型表达载体ppiczαa构建成功的重组酵母表达质粒ppiczαavp2，成功地表达了cpvvp2蛋白，初步试验证明表达的vp2蛋白具有反应原性。 【