柠檬籽中柠檬苦素类似物和柠檬籽油的研究

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1、广东药科大学硕士研究生学位论文分类号：___________密级：_________UDC：___________柠檬籽中柠檬苦素类似物和柠檬籽油的研究姓名：于红学号：2111540090院系：药学院学位类型：专业学位专业：药学研究方向：药物研发与转化导师：贲永光论文提交日期：2018年5月论文答辩日期：2018年5月18日学位授予单位：广东药科大学二〇一八年五月广东药科大学硕士研究生学位论文STUDYONLIMONOIDSANDOILFROMLEMONSEEDCandidate：YuHongStudentID：2111540090Affiliation：SchoolofPharmac

2、yAcademicDegreeApliedfor：ProfessionalDegreeofPharmacySpeciality：PharmacySupervisor：Prof.BiYong-GuangAssistantSupervisor：Prof.XuWen-DongDayofDefence：May2018Degree-Conferring-Institution：GuangdongPharmaceuticalUniversity52018广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学硕士研究生学位论文柠檬籽中柠檬苦素类似物和柠檬籽油的研究摘要柠檬（Citruslimon）为芸香科柑橘属

3、植物，广泛分布于亚热带地区。果实中富含维生素、糖类、柠檬酸、橙皮苷，多用作上等调味料，应用于饮料、菜肴、化妆品及药品等。柠檬籽是柠檬工业加工的主要副产物，其中含有大量的油脂类、黄酮类和柠檬苦素类化合物，随意丢弃会造成环境污染和资源浪费。本论文着重研究了柠檬籽中柠檬苦素类化合物的提取、分离纯化、结构鉴定及体外抗肿瘤活性，并比较了超声技术和索氏两种提取方法所得柠檬籽油中脂肪酸的成分差异。开展上述研究，以期为柠檬籽的综合利用提供理论指导和参考依据。具体的工作内容及结果如下：1.本论文以单因素实验结果为基础，以超声提取时间、温度和功率为自变量，以提取率为响应值，用响应面法（RSM）优化探头式超

4、声提取脱脂柠檬籽中柠檬苦素类似物的工艺条件，并通过DPPH和O清除实验测定了提取物的抗氧化活性。实验结果表明，2超声强化提取的最佳工艺条件为：提取时间为56min，温度为56°C，超声功率为300W，在此条件下柠檬苦素的提取率达到了6.02±0.07%（n=3），该提取物清除DPPH自由基和超氧阴离子的IC50分别为0.22±0.05mg/mL和0.51±0.03mg/mL。2.为了确定脱脂柠檬籽提取浸膏中的主要成分及含量，采用UPLC-TOF/MS和HPLC对其进行分析，通过柱色谱和重结晶两种方式对提取浸膏进行分离纯化。为研究柠檬苦素的构效关系，本论113文对柠檬苦素的7位基团进

5、行结构修饰，并通过H和CNMR技术鉴定其结构。UPLC-TOF/MS结果表明：脱脂柠檬籽提取物中的柠檬苦素类似物为柠檬苦素、诺米林和黄柏酮，三种化合物所占柠檬苦素类似物总量的比例分别为71.54%、23.72%和4.74%。由硅胶柱色谱分离技术可以得到以上三种化合物，其纯度分别为98.51%、97.83%、97.37%；由重结晶法可以分离得到柠檬苦素和诺米林两种I广东药科大学硕士研究生学位论文化合物，其纯度分别为93.21%和82.53%。NMR结果表明，对柠檬苦素进行结构修饰后所得产物为7-甲肟柠檬苦素。3.在活性试验部分，本论文通过CCK8法考察了柠檬苦素、诺米林、黄柏酮和7-甲肟

6、柠檬苦素作用于人乳腺癌细胞（MCF-7）、人结肠癌细胞（HT-29）和人前列腺癌细胞（LNCap）三种癌细胞48h的抑制作用，并采用流式细胞仪和SimpleWestern技术研究了黄柏酮和7-甲肟柠檬苦素对LNCap的作用机制。CCK8结果表明，柠檬苦素在低浓度（50µM）加药处理时会呈现析出现象且无显著抗增殖作用；诺米林作用于MCF-7和LNCap的IC50为485±0.04µM（P>0.05）和463±0.02µM（P<0.05）；黄柏酮作用于HT-29和LNCap的IC50为662±0.02µM（P>0.05）和236±0.03µM（P<0.05）；7-甲肟柠檬苦素作用于MCF-

7、7、HT-29、LNCap三种细胞的IC50为547±0.02µM（P>0.05）、366±0.03µM（P<0.05）、249±0.04µM（P<0.05）。由CCK8结果可知，柠檬苦素类似物（尤其是黄柏酮和7-甲肟柠檬苦素）对LNCap细胞的抑制作用最强；且柠檬苦素7位结构对该化合物的抗肿瘤活性有显著影响。细胞周期分布结果表明，黄柏酮主要将前列腺癌细胞阻滞在S期和G2/M期，7-甲肟柠檬苦素主要将细胞阻滞在G2/M期。WB结果表明黄柏酮和柠