hl-60细胞内核干细胞因子抑制后全基因组表达谱的变化

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterGeneprofilingafterknocking—downexpressionofnucleostemininHL一60cellsusingDNAmicroarrayThisstudywasfundedbyNSFC(81271911)ByXiaoliSunSupervisor：Prof．BaohongYueClinnicalLaboratoryDiagnosticsTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhou

2、UniversityMay,2013学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：否f)·日期：为>年y月；D日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和

3、借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：n同期：驰≥年，n30同摘要HL-60细胞内核干细胞因子抑制后全基因组表达谱的变化目的。构建针对核干细胞因子(nucleostemin，NS)基因的RNA干扰(RNAinterference，RNAi)慢病毒表达载体，并感染人p53缺失型白血病细胞株HL．60，确认其干扰有效后，进行

4、基因芯片实验和后续的生物信息学分析，探讨NS抑制后全基因组表达谱的改变，为进一步探索NS非依赖p53信号通路具体机制奠定基础。方法：(1)NS．siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定：针对NS基因的序列设计RNAi有效靶点，合成含RNA干扰序列、Loop环、AgeI和EcoRI酶切位点，以及终止信号的单链DNAoligo，经退火形成双链DNA，与双酶切线性化的带有GFP荧光标记和嘌呤霉素抗性标记的GV慢病毒空载体进行连接产生重组．248慢病毒载体，转化感受态细菌，挑取重组阳性转化子进行菌落PCR反应，并对PCR阳性克隆进行测序。将重组慢病毒载体及其两种辅助

5、包装原件载体质粒pHdperl．0和pHelper2．0共转染293T细胞进行病毒的包装，收集、浓缩病毒液后测定其滴度，并感染人白血病细胞株HL．60，倒置荧光显微镜下观察其转染效率，Real．timePCR检测NS基因的敲减效率。(2)基因芯片实验：以NS．siRNA重组慢病毒感染的HL一60细胞为实验组，阴性对照病毒感染的的HL．60细胞为对照组，提取细胞总RNA，纯化后进行质检，符合要求后后先逆转录为cDNA，并再次转录为带有Cy3标记的cRNA，经纯化后与芯片进行杂交反应，洗涤后进行扫描获取数据，将数据进行标准化和过滤后，以FoldChange'

6、，>2或≤0．5作为标准筛选差异表达的基因，并采用Real．timePCR对芯片结果进行验证，然后对差异表达基因行GO分析和Pathway分析，以P<0．05为有统计学意义，且P值越小，表明显著性越强。摘要结果：(1)经测序证实正确构建出了NS基因的RNAi重组慢病毒载体，包装、浓缩后其滴度为4×10“rU／ml，荧光显微镜下显示其能有效感染ttL-60细胞中，且转染效率在80％以上：Real-timePCR显示转染后Ns基因mRNA表达水平较阴性对照组显著下降(P<0．05)，抑制率为52．3％。(2)总RNA经检测后，其纯度、完整性和产量满足芯片杂交

7、的要求。经分析后共筛选出1953个差异表达的基因，其中943个基因在实验组中表达上调，1010个基因在实验组中表达下调。Real．timePCR证实了芯片结果数据的可靠性。经分析后，差异表达的的基因可涉及多种功能和信号通路，其中内质网中蛋白质生物通路变化和金属硫蛋白的变化最为显著。结论：(1)成功构建出了NS基因的RNAi慢病毒载体，其能有效干扰人白血病细胞株HL-60中NS基因的表达。(2)HL一60细胞中NS受到抑制后生物学特性的变化较为复杂，可能涉及到多种功能蛋白、代谢和信号通路，其中上调差异表达基因Pathway分析显示内质网中蛋白质生物通路变化

8、最为显著，而下调差异表达基因Pathway分析显示金属硫蛋白的变化较显著，提示N