日本血吸虫感染血清中循环抗原的筛选与鉴定

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1、万方数据中图分类号UDCR383．2610硕士学位论文学校代码密级10533日本血吸虫感染血清中循环抗原的筛选与鉴定ScreeningandidentificationofcirculatingantigeninserumfromrabbitinfectedwithSchistsoma]aponicum-一作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：彭交凤基础医学病原生物学基础医学院汪世平教授论文答辩日期兰!兰二竺二梦答辩委员会主席中南大学二。一四年五月万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所

2、呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：塑兰：!坠日期：j型兰年土月盟日学位论文版权使用授权书：本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论：丈的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机

3、构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、．缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：型兰：!坠日期：兰!±年』月型日导师签名万方数据日本血吸虫感染血清中循环抗原的筛选与鉴定摘要：寻找优势诊断抗原，一直是血吸虫病诊断研究中的热点。血吸虫循环抗原因其具有反映活动性感染情况、评估虫负荷和疗效考核价值等特点，一直倍受人们关注，寻找高敏感性和高特异性方法检测循环抗原，也是血吸虫病诊断研究长

4、期面临的挑战。鉴于本研究组在基因：[程抗体方面的前期研究工作，本课题旨在通过已经获得的SIEA26．28kDaSjscFv，利用其对日本血吸虫成虫、虫卵各发育阶段的高特异性靶向免疫识别能力，充分发挥其作为探针的作用，从日本血吸虫感染兔血清中，筛选血吸虫循环抗原组分，并利用NanoLC—MS／MS质谱以及生物信息学技术进行初步分析，鉴定循环抗原的相关组分，以期寻找具有高效诊断价值的血吸虫循环抗原，为建立高敏感性和高特异性检测循环抗原方法奠定基础。研究目的1．构建原核质粒pET43．1a／SjscFv，表达、纯

5、化与鉴定SjscFv目的蛋白。2．利用SjscFv筛选日本血吸虫感染兔血清中的循环抗原。3．通过质谱和生物信息学技术手段，分析循环抗原相关组分的结构与功能，鉴定出具有诊断价值的候选抗原分子。研究方法1．原核质粒的构建及SjscFv蛋白的表达、纯化与鉴定根据SjscFv基因开放阅读框架(ORF)设计上下游引物，以pET28a／SIEA26-28kDa-SjscFv质粒为模板，构建pET43．1a／SjscFv原本研究由国家科技支撑计划(2009BAl78805)、国家自然科学基金项目(811271862)、中

6、南大学研究生创新项目(2012zzts028)联合资助万方数据核质粒，经PCR、双酶切和DNA测序鉴定重组质粒构建是否成功。以最佳诱导条件大量培养BLZl(DE3)大肠杆菌表达SjscFv目的蛋白，Westernblot鉴定该蛋白活性，Ni．柱层析法纯化蛋白并测定蛋白浓度。2．日本血吸虫感染兔血清中循环抗原的筛选通过SDS．PAGE和Native．PAGE凝胶电泳、WesternBlot技术，利用pET43．1a／SjscFv蛋白识别日本血吸虫感染兔血清中的循环抗原相关组分，寻找感染阳性兔血清与重组蛋白特异

7、结合的抗原条带。通过电泳收集特异条带并进行电洗脱纯化。同时，将纯化抗原与佐剂等体积混匀后免疫新西兰兔，制备循环抗原相关组分免疫血清，采用血吸虫成虫和感染兔肝制作石蜡切片，进行免疫荧光组化定位。3．NanoLC．ESI．MS／MS质谱技术分析SjscFv识别的血吸虫感染兔血清中循环抗原的组分；通过生物信息学技术分析循环抗原相关组分的结构与功能。研究结果1．成功构建了原核质粒pET43．1a／SjscFv，经PCR、双酶切及DNA测序结果均证实所构建质粒pET43．Ia／SjscFv中基因片段与目的片段一致。诱

8、导表达pET43．1aJSjscFv工程菌，在约91kDa处获得大量表达蛋白，优化的最佳表达条件为：IPTG浓度为0．05mmol／L，温度为28℃，时间为过夜。采用WesternBlot分析证实表达蛋白与目的蛋白一致。经镍柱层析法纯化后，SIEA26．28kDa．SjscFv蛋白浓度可达到O．339mg／mL。2．采用SIEA26．28kDa-SjscFv进行WesternBlot分析，发现SIEA26．28k