生物活性玻璃对致龋菌及龈上菌斑的抗菌效果研究

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分类号：R78密级：单位代码：10312学号：20111266南京医科犬掌硕士学位论文题目：研究生：许玉婷指导教师：陈亚明教授学科专业：口腔临床医学学院名称：南京医科大学口腔医学院完成时间：二。一四年五月 南京医科大学硕士学位论文寰毫苎氅：㈣煳学位论文原创性声明～一～。本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：导师签名：鹊文从1／日期：声l阵钳日日期：．20I降∥月乡日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于(请在以下相应方框内打“寸’)：1、保密0，在一年解密后适用本授权书。2、不保密髟作者签名：导师签名：日期：必f降自<日日期：加／绎汐月j日，／ 南京医科大学硕士学位论文目录缩略词索引表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯第一部分生物活性玻璃对三种需氧菌和龈上菌斑的抗菌效果研究1、材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112、结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯133、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯154、结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯175、附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯186、参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19第二部分生物活性玻璃联合氟及三氯生对变形链球菌菌斑的抗菌效果研究1、材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212、结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯304、结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯335、附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯346、参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38生物活性玻璃的技术资料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42攻读学位期间发表文章情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯57致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58 南京医科大学硕士学位论文缩略语表缩略词英文全称中文全称ADAATCCAmericanDentalAssociation美国牙科协会Americantypeculturecollection美国模式菌种收集中心A．viscosusActinomycesviscosusBAGBHICFUBioacitveglassBrainHeartInfusionColonyformationunit粘性放线茵生物活性玻璃脑心浸液菌落形成单位CGMCCChinaGeneralMicrobiologicalCulture中国普通微生物保藏管CHXCLSMEMPFDACollectionCenterChlorhexidineConfocalLaserScanningMicroscope理中心氯己定(洗必泰)激光共聚焦显微镜EmbdenMeyerhofParnasPathway埃姆登．迈耶霍夫途径FoodandDrugAdministration美国食品药物管理署FE-SEMFieldemissionscanningelectron场发射扫描电镜MBCMCFmicroscopeMinimalbactericidalconcentration最小杀菌浓度McFarland麦氏浊度单位 南京医科大学硕士学位论文MICPTSMinimalinhibitoryconcentration最小抑菌浓度Sugarphosphotransferasesystem磷酸转移酶系统SmutansStreptococcusmu砌ns＆sanguinisStreptococcussanguinisSEMScanningelectronmicroscopeTCSTriclosanWHOWorldHealthOrganization变形链球菌血链球菌扫描电镜三氯生世界卫生组织注：缩略词按英文字母先后顺序排序2 南京医科大学硕士学位论文生物活性玻璃对致龋菌及龈缘菌斑的抗菌效果研究南京医科大学口腔医学院研究生：许玉婷导师：陈亚明教授中文摘要菌斑是导致龋病的四联因素之一。多年来，研究人员一直在不断研究和开发抗菌剂来抑制致龋菌及其菌斑。除了传统的氟化物(fluoride)、洗必泰(crix，chlorhexidine)、三氯生fits，triclosan)等抗菌剂外，新型的生物抗菌材料也在不断地被开发和应用。生物活性玻璃(BAG，Bioactiveglass)是由钠、钙、磷、硅等氧化物组成的具有生物活性的生物材料，能够有效治疗牙本质过敏症并具有一定再矿化作用，对早期龋有一定治疗作用眦1。此外，多项试验研究证明其对多种口腔细菌具有杀菌效果【3'4J。但有关其抗酸能力和对菌斑的抗菌效果则缺乏相关研究。本实验旨在探究生物活性玻璃对三种主要致龋茵的抑制和杀灭能力、抵抗产酸能力及对早期血链球菌菌斑和混合龈上菌斑的抗菌效果，为临床应用生物活性玻璃提高牙齿的抗龋能力提供理论依据；比较单一和联合使用生物活性玻璃、氟、三氯生三种抗菌剂的抗菌效果，探讨最佳使用方法和相关机理，为生物活性玻璃的口腔临床应用和进一步深入研究提供新线索。第一部分生物活性玻璃对三种需氧菌和龈上菌斑的抗菌效果研究目的研究不同浓度生物活性玻璃对三种游离致龋菌、血链球菌菌斑及混合菌斑的抗菌效果。3 南京医科大学硕士学位论文方法测定生物活性玻璃对血链球菌、变形链球菌和粘性放线菌的最小抑菌浓度(MIC，Minimalinhibitoryconcentration)和最小杀菌浓度(MBC，Minimalbactericidalconcentration)，并测定pH值。37．5、75、150mg／ml生物活性玻璃处理24h血链球菌菌斑和48h混合菌斑10min后分别于场发射扫描电镜(FE．SEM，Fieldemissionscanningelectronmicroscope)和激光共聚焦显微镜(CLSM，ConfocalLaserScanningMicroscope)下摄片分析。结果低浓度生物玻璃能够抑制细菌产酸，且pH值与空白组有显著性差异(P<0．001)。场发射扫描电镜和激光共聚焦均可见随生物活性玻璃浓度升高，细菌团块变小，层次变薄。结论生物活性玻璃能够在10min内杀灭细菌，对24h单菌种和48h多菌种菌斑均有一定抑制作用。在浓度较低(1／4MIC，2．35-18．75mg／m1)情况下仍能发挥一定抗菌和抗酸能力。关键词生物玻璃；生物活性玻璃；抗菌效果；菌斑第二部分生物活性玻璃联合氟及三氯生对变形链球茵菌斑抗菌效果研究目的探究生物活性玻璃与三氯生、氟联合使用对菌斑的抗菌效果。方法将变形链球菌菌液置入放有玻片的24孔板，厌氧培养24h后形成早期变形链球菌菌斑。实验药物分成9组：生理盐水组，1MBC组和2MBC组(生物活性玻璃组，氟化钠组，三氯生组)，生物活性玻璃加氟化钠组，生物活性玻璃加三氯生组。将菌斑浸入实验药物10min后冲洗，平板计数观测细菌活性，扫描电镜观察菌斑结构变化，激光共聚焦计数观察活死菌比。结果平板计数的结果表明联合应用效果优于单独使用抗菌剂。扫描电镜显示联合应用抗菌剂后的菌斑叠层结构变得更小，周围围绕的细菌数目大大减少，只剩一层链网状结构，并且暴露出玻片。激光共聚焦结果显示生物活性玻璃在菌斑中有着良好的渗透杀菌效果，同时亦能增加三氯生和氟化钠的渗透性。结论生物活性玻璃与氟化钠、三氯生联合使用效果与单独使用这三种抗菌剂4 南京医科大学硕士学位论文的总效应增强136．43~464．16％。关键词生物活性玻璃，氟，三氯生，联合应用，抗菌5 AntimicrobialeffectofbioactiveglassoncariousbacteriaandsupergingivalbiofilmsinvitroCandidateformaster：XuYutingSupervisor：Professor：ChenYamingSchoolofStomatology,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029，ChinaAbstractDentalplaqueisoneofthefactorsthatleadtodentalcaries．Numerousofantimicrobialshavebeendevelopedtoinhibitcariousbacteriaandplaque．Excepttraditionalantimicrobials，suchasfluoride，chlorhexidineandlriclosan．Novelbiologicalantimicrobialmaterialsarecontinuouslybeingreseachedandapplied．Bioactiveglasscontainsoxidesofsodium，calcium，silicaandphosphorus，andhassomeextentofbiologicalactivitiestocuredentinhypersensitivityandremineralizedentalcaries．Thisstudyaimedtoresearchtheantibacterialandantiplaqueeffectofbioactiveglassandcomparetheutilizationsofthreeantimicrobialsortheircombinations．Theresultsandmechanismsmayprovidesomeevidenceofnewapplicationsfordentalclinics．PartISterlizedeffectofbioactiveglassonthreeoralDacteriaandSUpergInglVaID10lnmSl·‘1●●■●什■objectiveToevaluatetheeffectofbioactiveglass谢tlldifferentconcentrationsonthreeplanktonicbacteria,singleStreptococcussanguisbiofilmandmixedbiofilm．MethodsThreekindsofbacteria,Streptococcussanguis，StreptococcusmutansandActinomycesviscosuswereusedtodeterminetheMinimalinhibitory6 南京医科大学硕士学位论文concentration(MIC)andMinimalbactericidalconcentration(MBC)，andthepHvalueweremeasuredaswell．Fieldemissionscanningelectronmicroscope(FE-SEM)wasutilizedtoobservetheantibacterialeffectof24hStreptococcussanguisbiofilmafter10minexposureto37．5，75，150mg／mlbioactiveglass．Theeffectofbioactiveglasson24hmixedbiofilmwereobservedunderconfocallaserscanningmicroscopy(CLSM)．ResultsTheacid-inhibitionabilitycouldalsobeobservedatlowconcentrationofbioactiveglass，andasignificantdifference(P变形链球菌>血链球菌，杀菌能力依次为：变形链球菌>血链球菌、粘性放线菌。由此可见，相对于变形链球菌和粘性放线菌，血链球菌对生物活性玻璃更不敏感。主要致龋菌变形链球菌则相对容易被抑制和杀灭。表1三种细菌的MIC和MBCTablelMICandMBCagainstthreebacteria2．2酸碱度实验结果实验组和对照组的pH值见表2。单因素方法分析结果显示每组均有统计学差异(P6。当15腔环境内pH<5时，羟基磷灰石即会发生脱矿【13】。因此，生物活性玻璃溶解产生的高pH值溶液不仅能杀菌抑菌，亦能调节整个液体环境pH，降低牙体脱矿的风险。Stoor等[3]早在1998年即发现生物玻璃能在10min内释放大部分离子，并使pH值达到峰值。较高渗透压和pH能够使邻近的细菌短时间内大部分或全部失去活性。对早期生物膜也采用短时间生物玻璃处理后发现无论是单菌种菌斑还是混合菌斑，细菌数目、菌斑密度和厚度都随着生物玻璃浓度增加而减少。通常情况下，菌斑内细菌存在于缺乏氧气和营养的竞争环境之中，代谢缓慢，对抗菌药物的敏感度低，同时胞外基质的存在也降低了药物的渗透性[141。本实验中，可能是因为菌斑未成熟，未形成完全密闭的内部环境【14]，因此渗透压和16 南京医科大学硕十学位论文pH的改变能够引起内层细菌活性的丧失，使细菌由大量团聚变成短链状的少量聚集。有学者通过透射电镜发现：生物活性玻璃可产生玻璃碎片，刺破大肠杆菌细胞壁‘15】，使细菌失去完整结构。本实验扫描电镜观察发现：个别血链球菌失去原有饱满外形，变得皱缩和有小破孔，推测与生物玻璃碎片有关，但大部分破裂细菌因失活而被冲走，无法观察表面形态。成熟菌斑具有更完整的分层结构和对抗菌物质的抵抗能力，因此生物玻璃能否对5～6天的混合菌斑有着同样良好的抗菌效果，值得进一步研究。武汉大学台保军等【16】临床实验表明，连续使用生物玻璃牙膏六周能使牙龈出血率降低58．8％，菌斑增长率降低16．4％。如何根据生物玻璃的抗菌特性拓宽其临床应用范围，是今后生物玻璃研究和发展方向之一。4结论生物活性玻璃能够在1Omin内杀灭细菌，对24h单菌种和多菌种菌斑均有一定抑制作用。在浓度较1'氏(1／4MIC，2．35～18．75mg／m1)情况下仍能发挥一定抗菌和抗酸能力。17 南京医科大学硕十学位沦文5附图图1图3图2图1厌氧培养箱图2液体、固体培养基图3场发射扫描电镜图4紫外线无菌操作台18图4 南京医科大学硕士学位论文参考文献[1】熊正慧，夏露，梅蕾，韩光政，陈亚明．三种新型钙盐脱敏剂封闭牙本质小管的体外研究．中华El腔医学杂志．201l，46(4)：214．7．【2】武琼，史舒雅，陈亚明，吴新，李次会．生物活性玻璃促进敏感牙本质再矿化的体外研究．口腔材料器械杂志．2013，22(2)：81．5．[3】StoorP．，E．SoderlingandJ．I．Salonen，Antibacterialeffectsofabioactiveglasspasteonoralmicroorganisms．ActaOdontolScand，1998．56(3)：161·5．[4】AllanI．，H．NewmanandM．Wilson，Antibacterialactivityofparticulatebioglassagainstsupra-andsubgingivalbacteria．Biomaterials，2001．22(12)：1683-7．[5]SreenivasanP，GaffarA，Antiplaquebiocidesandbacterialresistance：areview．JournalofClinicalPeriodontol，2002．29：965·74．[6]DongZ．H．，ChangJ．,XhouY．，LinK．L．，Invitroremineralizationofhumandentalenamelbybioactiveglasses．JMasteSci，2011．46(6)：1591-6．【7】7JonesJ．R．，Reviewofbioactiveglass：fromHenchtohybrids．ActaBiomater，2013．9(1)：4457—86．[8】ElisabethP，StefanH，AndreaML，AlexanderMH，JohannesH，WolfgangG．EffectsofAzithromycininCombinationwithVancomycin，daptomycin，Fosfomycin，Tigecycine，andCeftriaxoneonStaphylococcusepidermidisBiofilms．AntimicrobialAgentsandChemotherapy，2009，53(8)：3205-10．[9】WangZ．，JiangT，SauroS，PashleyDH，ToledanoM，OsorioRLiangS，XingWSaYWangYThedentineremineralizationactivityofadesensitizingbioactiveglass-containingtoothpaste：aninvitrostudy．AustDentJ，2011．56(4)：372·81．[10】VollenweiderM．，BrunnerTJ，KnechtS，GrassRN，ZehnderM，ImfeldT，StarkWJ．，Remineralizationofhumandentinusingultrafinebioactiveglassparticles．ActaBiomater，2007．3(6)：936-43．19 南京医科大学硕士学位论文[11]AllanI．，H．NewmanandM．Wilson，ParticulateBioglassreducestheviabilityofbacterialbiofilmsformedonitssurfaceinallinvitromodel．ClinOralImplantsRes，2002．13(1)：53—8．【12】ZhangD，LepparantaO，MunukkaE，YlanenH，ViljanenMK，EerolaE，HupaM，HupaL．Antibacterialeffectsanddissolutionbehaviorofsixbioactiveglasses．JBiomedMaterResA．2010，93(2)：475—483．[13]岳松龄．脱矿与再矿化——病变的主线龋病学研究百年回顾与展望之七．牙体牙髓牙周病学杂志．2008，l8(1)：1—8．[14】MarshPD．Dentalplaqueasamicrobialbiofilm．CariesRes．2004，38(3)：204．211．[15】HuS，ChangJ，LiuM，imgC．Studyonantibacterialeffectof45S5Bioglass．JMaterSciMaterMed．2009，20(1)：281—286．[16】TaiBJ，BianZ，JiangH，GmenspanDC，ZhongJ，ClarkAE，DuMQ．Anti-gingivitiseffectofadentifricecontainingbioactiveglass(NovaMin)particulate．JClinPeriodont01．2006，33(2)：86—91．20 南京医科大学硕士学位论文第二部分生物活性玻璃联合氟化钠和三氯生对变形链球菌菌斑抑制的体外研究l材料与方法1．1实验材料与器械变形链球菌(Streptococcusmu幻ns，ATCC25175)由中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC，北京)提供。生物活性玻璃由北京大清生物技术有限公司提供，为粉体结构，粉体颗粒，最大直径小于90rtm。氟化钠化钠(分析纯，中国镇江市化剂厂，批号：F10019618)，三氯生(分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司，批号：E1222016)，牛心脑浸出液(BHI，Oxoid，英国)，琼脂(Biosharp，日本)LIVE／DEAD@BacLightTMBacterialViabilityKit(L13152Invitrogen，美国，批号：1174157)，24孔板(Costar3524，Coming，USA)细菌浊度仪(WGZ．2XJ，上海昕瑞)，场发射扫描电镜(LEO1530VP，德国)，激光共聚焦显微镜(ZEISSLSM710，德国)，体式显微镜(SUEl000，尼康，日本)。将25mg三氯生溶于1．0mL的无水乙醇中，取其中1001al加入900I．tl的双蒸水中，制成2．5mg／mL的三氯生溶液贮存。使用时用双蒸水稀释到所需浓度。氟化钠使用溶液形式贮存，使用时十倍稀释。1．2实验方法1．2．1细菌培养变形链球菌(ATCC25175)冻干粉由中国普通微生物保藏中心(CGMCC)提供。将冻干粉复苏于牛心脑浸出液平板上，在80％N2，10％H2和10％C02的厌氧环境下孵育，经过一夜37。C培养后，挑取平板上的菌落置于含有牛心脑浸出液的试管中培养，隔日液体培养基继续传代培养。传代后每隔一小时，将变形链球茵培养液吹打均匀，取适量加入分光光度计中测试吸光度并记录。9h数据记录之后，将数据输入计算机，绘制生长曲线，21 南京医科大学硕士学位论文记录对数期时间。1．2．2形成变形链球菌菌斑稀释处于对数期的变形链球菌菌液至0．5MCF(大约1．0×108CFU／mL)。将调整后的菌液再稀释100倍，使得菌液浓度达到1．Oxl06CFU／mL。在3个24孔板(Costar3524，Coming，USA)中放入54片1cm×lcm已消毒玻片，将24孔板标记为1、2、3号，随后加入O．1ml1％蔗糖，1．5mlBHI培养液和0．1ml菌液。将24孔板放入厌氧培养箱中37℃培养6，12和24h，其间不再加入新鲜培养液。1．2．3测定MIC和MBC用常量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC，minimalinhibitoryconcentration)，具体步骤根据AntimicrobialSusceptibilityTestingProtocols(RichardSchwalbe等编写，2007)t11。将生物活性玻璃浓度二倍稀释，加入菌液中共同培养24h后，用肉眼观察液体澄清度，含有最小生物活性玻璃浓度的澄清试管即为最小抑菌浓度管。取最小抑菌浓度管和比该管浓度更高的邻近四管的溶液1001al均匀滴入琼脂平板，48h培养之后记录平板上的菌落个数。不足O．1％细菌存活的平板所对应的试管即为最小杀菌浓度管。同理测定氟化钠和三氯生的MIC和MBC，本实验重复三次。1．2．4生物活性玻璃对茵斑的抗菌效果为了测定细菌对玻片的粘附量，分别在6、12、24h分别取出1、2、3号24孔板。用生理盐水以5s／1滴的速度轻轻冲洗玻片两次，在三种抗菌剂的MBC基础上，分成以下九组：1MBC的生物活性玻璃、氟化钠、三氯生，2MBC的生物活性玻璃、氟化钠、三氯生，1MBC的生物活性玻璃联合1MBC的氟化钠或者三氯生，生理盐水组。将54片玻片分成九组，三个时间点，每个时间点每组两片。将玻片放入试剂前，先涡旋震荡试剂保证其匀质性。在玻片与九组试剂共培养10min后，取出玻片，生理盐水轻轻冲洗五次，放入装有lml生理盐水离心管中。离心管经过涡旋震荡3min，再用超声震荡10min(KQ500B，昆山，22 南京医科大学硕士学位论文中国)。随后将离心管中溶液十倍稀释数次，依次取稀释管中液体109l铺板，48h后在体式显微镜下计数，并抽取部分菌落做染色和形态鉴定。本实验重复三次。1．2．5扫描电镜观察处理后的菌斑选择用1MBC生物活性玻璃、氟化钠、三氯生，1MBC生物活性玻璃联合1MBC氟化钠或者三氯生，生理盐水组共六组处理培养24h的菌斑玻片，处理后将玻片浸入2．5％戊二醛溶液中避光低温(4℃)保存24h，随后用不同浓度乙醇梯度脱水，浓度分别为50％，70％，90％，100％，每个浓度浸泡30min。最后再常温下风干，喷金，在场发射扫描电镜12kv电压下进行形态和数量的观察。1．2．6荧光染色观察处理后菌斑将lcmxlcm盖玻片置入24孔板中，每孔中均加入约0．1mll05CFU枷的变形链球菌菌液、1．5ml培养基和0．1m11％蔗糖。培养24h后生理盐水冲洗2遍，样本分别用1MBC的生物活性玻璃、氟化钠、三氯生，1MBC的生物活性玻璃联合1MBC的氟化钠或者三氯生，生理盐水处理10min后，生理盐水冲洗5遍。避光加入LIVE／DEAD⑩BacLi∥BacterialL13152荧光染色，锡纸密封后于摇床上低速匀染15min，再加入lml生理盐水洗脱多余染料，10min后将盖玻片置于ZEISSLSM710倒置激光共聚焦显微镜下观察。488nm／561nm光源激发后，活菌与SYT09结合发出绿色荧光，死菌细胞核DNA与PI结合发出红色荧光。分层摄片，统计红绿荧光面积，计算比值，实验组各含三个样本。1．2．7统计分析平板计数使用两因素方差分析时间和试剂对细菌数目的影响。此外，在每个时间点使用单因素方差分析，并用LSD进行两两比较分析同一时间点实验组之间的统计学意义。荧光染色结果由绿色荧光量除以总荧光量得出活菌百分比，通过秩和检验Kruskal．Wallis和Mann．Whitney来计算活菌百分比之间的差异。以上检验均用SPSS(17．0版本)计算，结果中P<0．05认为具有统计学意义。 南京医科大学硕士学位论文2结果2．1变形链球菌的MIC和MBCMIC和MBC值见表1，该表显示变形链球菌对三种抗菌剂不同的敏感度。表中可见不同抗菌剂具有不同的抑菌和杀菌范围。MIC值表示能够抑制变形链球菌生长繁殖的抗菌剂浓度。用同样的试管溶液，我们以48h平板计数方式检测了三种抗菌剂的MBC。表1不同抗菌剂对变链的MIC和MBCTablelMICsandMBCsagainstS．mutans2．2抗菌剂对不同时期菌斑的抗菌作用两因素方差分析显示活菌计数随着时间和抗茵剂的不同而不同(P0．05)，校正R2为0．682。单纯用一种抗菌剂处理(1MBC，2MBC)和联合使用抗菌剂的结果均显示于柱状图中(图1)。在每个时间点，活菌数目都有统计学差异(P0．05)。3●koP西o1S。口Control口1BAG口1NaF目1TCSl2BAG圈2NaF皿2TCS圜BAG+NaF图BAG+TCS图1不同抗菌剂在三个时间点杀菌效果图Fig．1Antibacterialeffectsofantimicrobialsat3points1MBC和2MBC生物活性玻璃，氟化钠和三氯生，以及生物活性玻璃和氟化钠或三氯生联合使用10min的平板计数结果。计数结果以对数形式表示，为图表纵坐标，横坐标为三个时间点。+表示在同一时间内与该时间段对照组相比具有统计学意义(PO．05)，而与生物活性玻璃和氟化钠联合应用有差异(P=O．016)。结果显示生物活性玻璃在菌斑中有着良好的渗透杀菌效果，28 南京医科大学硕十学位论文同时亦能增加三氯生和氟化钠的渗透性。图4变形链球菌菌斑用荧光染料染色后，在488／561nm激发下的图像。Fig．4Imagesofbiofilmsstainedwithfluorescentdye绿色荧光代表活菌，红色荧光代表死菌。A)生理盐水组B)2MBCBAGD)2MBCTCSE)IMBCNaF+BAGF11MBCTCS+BAG。29 南京医科大学硕十学位论文10080抗菌剂图5激光共聚焦显微镜红绿荧光比值图Fig．TheratioimagesofRed-Greenfluorescent每组样本量为3个，共6组。每个样本分三层，每层随机取6个视野计算活菌百分比。活菌百分比(Vatality％)=绿色荧光量／红色荧光量-|=绿色荧光量。最高点和最低点分别代表2．5％和97．5％值，方盒上下端代表四分位数。木木：Ic代表P． 南京医科大学硕士学位论文比起氟化钠和生物活性玻璃，三氯生有着更宽广的应用领域，如洗手皂、塑料、织物、牙膏和漱口水等。McMurry等证明了三氯生能够抑制细菌的FabI基因，从而导致脂质合成障碍【61。但口腔致病菌变形链球菌并没有FabI基Ntn。相反，变形链球菌中的FabM能够帮助链球菌增强对三氯生的抵抗【8】。有研究表明低浓度三氯生即对生长期细菌能起到抑制作用，而高浓度三氯生可影响处于任何时期的细菌。这说明除了FabI的抑制作用之外，还有其他途径能够影响细菌代谢途径和合成机制。2006年，Phan[91等报导了三氯生能通过抑制细菌胞膜上的F(H+)．ATP酶和糖酵解过程导致细菌死亡。特别是针对缺乏FabI基因的细菌，这种抑制可能是杀灭它们的主要机制。本实验中所用到的高浓度三氯生(3199／m1)口-]"杀灭变形链球菌菌斑表层的细菌，但是随着抗菌剂的逐步渗透，局部药物浓度减低，仅能够杀死处于生长期的变形链球菌，同时抑制糖酵解过程和产酸【l01。本实验抗菌剂和菌斑接触时间较短，已有实验表明使用0．3％--氯生刷牙后，三氯生能够长久地停留在菌斑中，起到持续的抗菌效果【l¨。所以三氯生对细菌的作用不仅体现在即使反应，更包含了后续的抑菌作用。但该药的致癌传言让人们产生了一定的疑虑，使得它在目前中国牙膏市场中的应用大幅减少。在多年的口腔预防措施中，氟扮演了不可或缺的角色，它不仅能再矿化早期脱矿部分，更能形成氟羟磷灰石增强釉质对酸性产物的抵抗。同时亦能主动抑制相关酶类，如烯醇酶，硫酸酯酶，过氧化氢酶，磷酸酶，磷酸葡萄糖酸酶等，以及细胞质和胞膜上的质子转移F-ATP酶【12d41。最后导致细胞质酸化，降低细菌对酸性环境的耐受性。此外，氟的使用剂量也与抗菌结果密切相关。在高氟环境下(>10mM)，氟对细菌碳水化合物的抑制可不受pH值的影响，而当氟浓度偏低时，氟对糖酵解的影响程度与pH值相关，pH低时随着氟浓度增加而抑制效果增强，pH为7．0时抑制效果微弱【151。可见，理论上，随着菌斑厚度增加，越深层的细菌，周围酸度越高，而氟在相对低浓度(<10mM)也有一定抑菌效果。但在CLSM结果中，三氯生的渗透杀菌效果优于氟化钠。可能3l 南京医科大学硕士学位论文的原因是氟的起效浓度取决于氟在细菌胞内与细胞器结合的量，但这种结合很不稳定的，轻度酸化即能使之分离。所以，在这些胞内的氟离子中，未结合、未反应、结合了又脱离的氟离子数目也是不可忽视的。遗憾的是，目前尚无能够准确测定菌斑中与细菌结合的氟量，故有多少氟能够参与细胞质酸化过程仍不得而知。本实验中生物活性玻璃表现出快速有效的抗菌特性。快速地遇水溶解产生碱性离子被认为是生物活性玻璃能够杀菌的关键机制，这一过程包括了渗透压升高和pH值快速增加【16】。实验中所用到的生物活性玻璃有着较高的比表面积，比表面积越高，其溶解速度越快，杀菌也就越迅速。由于重力作用，一部分生物活性玻璃颗粒直接与变形链球菌接触，接触面附近的pH值急剧增加，远高于溶液的平均pH值，导致短时间内接触区的细菌蛋白质变性，或者是渗透压增加造成细菌失水。正如CLSM图像所示(图3)，与生理盐水组相比，含有生物活性玻璃的组活菌百分数较低，提示生物活性玻璃有着较好的渗透杀菌性能。可能原因是生物玻璃在溶液中持续释放碱性离子，并且将这些离子扩散入叠层状及网状结构内部。Gubler[17】的一项实验证明，在牙面上有细菌粘附的前提下放入生物活性玻璃，反应一段时间后冲洗摄片，发现牙片上既无再矿化的类羟基磷灰石物质，也无细菌粘附。可见生物活性玻璃在接触细菌时并无再矿化作用，析出的离子连续地影响细菌的代谢，最终导致细菌溶解破裂。本实验中，生物活性玻璃处理过的细菌在3000倍的扫描电镜下，可以看到细菌表面约200nm左右的孔洞凹陷(图3)。另一学者的研究中也有类似发现，用透射电镜(TEM)观察生物活性玻璃处理过的大肠杆菌时可见，生物活性玻璃所产生的大量针状玻璃簇能够刺破大肠杆菌的细胞壁，导致细胞破裂。另有少量玻璃簇也粘附在细菌壁上，干扰细胞膜的结构，增加胞膜渗透性【l引。不同抗菌剂的抗菌效果与其局部的浓度以及不同的抗菌机制密切相关。生物玻璃有着较高的局部浓度和较大的pH值改变，而氟和三氯生缓慢地渗透入细胞膜，与多种酶结合反应。但是，成熟菌斑的对最小杀菌浓度的抗菌剂皆有32 南京医科大学硕十学位论文不同程度地抵抗。1MBC的生物活性玻璃几乎对24h的菌斑没有杀菌作用(P>0．05)。抗菌剂的联合使用增强了对菌斑的杀菌效果，一部分原因是细菌表面的孔洞为抗菌剂打开了通道，增加了对酶的抑制效果，最后导致糖酵解的抑制。另一部分是因为氟和钙磷离子的相互作用。在1998年，Rose等发现氟能够提高钙离子在菌斑中的扩散。有报道称0．049／L钙离子即能够使牙龈卟啉单胞菌发生凝集反应，而实际生物活性玻璃溶解时的钙离子浓度可以达到3．0—3．5∥L。钙离子的扩散能够加大其凝集作用【l91。另一位学者Kaufmann则报导磷离子能够帮助氟在低浓度下(<10mM)达到更多的烯醇酶抑制【2叭。钙和磷是生物活性玻璃的主要成分，在菌斑中与氟相互作用，共同达到杀菌目的。本实验结果表明，氟的加入能够提高生物活性玻璃的抗菌效果。近年来有研究表明，氟亦能够促进生物活性玻璃生成再矿化物质，达到更快治疗牙本质过敏的目的【211。但是，氟和生物活性玻璃的联合应用所起到的抗菌和再矿化效果仍需进一步的深入探讨和研究。4结论为研究三种抗菌剂的不同抗菌效果，研究者使用1MBC和2MBC的抗菌剂以●及生物活性玻璃和两种抗菌剂的联合使用来观察对变形链球菌菌斑的抗菌效果。无论是氟还是三氯生，与生物活性玻璃联合使用的效果均优于单独使用一种抗菌剂。增加生物活性玻璃的使用剂量同样能够增强其抗菌效果。因此，在短时间使用抗菌剂时，生物活性玻璃和氟化钠及三氯生的联合使用能够大大提高抗菌效果。而从不含氟的应用角度来看，单纯增加生物活性玻璃的量亦能提高抗菌效果。33 南京医科大学硕十学位论文5、附图图2．1图2．2图2．334图2．4 南京医科大学硕士学位论文参考文献[1]RichardSchwalbe，LynnSteele-Moore，AveryC．Goodwin，AntimicrobialSusceptibilityTestingProtocolsCRCPress，2007，432。[2]MarshPD．Dentalplaqueasamicrobialbiofilm．CariesRes．2004，38(3)：204．11．[3]GilbertP，Maira-LitranT，McbainAJ,RickardAH，WhyteFW．Thephysiologyandcollectiverecalcitranceofmicrobialbiofilmcommunities．AdvMicrobPhysi01．2002，46：202-56．[4]PasseriniDRB，FeldmanL，PinedaMS,VayC，FrancoM．Comparativeinvitroefficaciesofethan01．，EDTA．andlevofloxacin．basedcatheterlocksolutionsoneradicationofStenotrophomonasmaltophiliabiofilms．JMedMicrobi01．2012，61(Pt9、：1248·53．[5]TongZ，ZhouL，JiangW，Kuang＆LiJ，TaoRNiLong．AninvitrosynergeticevaluationoftheuseofnisinandsodiumfluorideorchlorhexidineagainstStreptococcusmutans．Peptides．2011，32(10)：2021-6．[6]McmurryLM，OethingerM，LevySB．Triclosantargetslipidsynthesis．Nature．1998，394(6693)：531-2．【7]HeathRJ，RockCO．Atriclosan—resistantbacterialenzyme．Nature．2000，406(6792)：145—6．【8]FozoEM，QuiveyRJ．ThefabMgeneproductofStreptococcusmutansisresponsibleforthesymhesisofmonounsaturatedfattyacidsandisnecessaryforsurvivalatlowpH．JBacteri01．2004，186(13)：4152-8．[9]PhanTN，MarquisRE．TriclosaninhibitionofmembraneenzymesandglycolysisofStreptococcusmutansinsuspensionsandbiofilms．CanJMicrobi01．2006，52(10)：977-83．[10】EscaladaMG，RussellAD，MaillardJY，OchsD．Triclosan．bacteria35 南京医科大学硕士学位论文interactions：singleormultipletargetsites7．LettApplMicrobi01．2005，41(6)：476．481．【11]HallPJ，GreenAK，HorayCP，deBrabanderS，BeasleyTJ，CromwellVJ，HoltJS，SavageDJ．Plaqueantibacteriallevelsfollowingcontrolledfoodintakeanduseofatoothpastecontaining2％zinccitrateandO．3％Triclosan．IntDentJ．2003，53(6Suppl1)：379-84．【12]MarquisRE．Antimicrobialactionsoffluoridefororalbacteria．CanJMicrobi01．1995，41(11)：955-64．[13]BunickFJ，KashketS．Enolasesfromfluoride-sensitiveandfluoride·resistantstreptococci．InfectImlTlUn．1981，34(3)：856—63．[14]SuttonSV，BenderG凡MarquisRE．Fluorideinhibitionofproton-translocatingATPasesoforalbacteria．InfectImnlun．1987，55(11)：2597．603．[15]BalzarES，LinderLE，SundML，eta1．EffectoffluorideonglucoseincorporationandmetabolisminbiofilmcellsofStreptococcusmutans．EurJOralSci．2001，109(3)：182—6．[16]ZhangD，LepparantaO，MunukkaE，YlanenH，ViljaDenMK，EerolaE，HupaM，HupaL．Antibacterialeffectsanddissolutionbehaviorofsixbioactiveglasses．JBiomedMaterResA．2010，93(2)：475—83．[17]GublerM，BrunnerTJ，ZehnderM，WaltimoT，SenerB，StarkWJ．DobioactiveglassesconveyadisinfectingmechanismbeyondamereincreaseinpH7．IntEndodJ．2008，4l(8)：670—8．【18]HuS，ChangJ，LiuM，NingC．Studyonantibacterialeffectof45S5Bioglass．JMaterSciMaterMed．2009，20(1)：281-6．[19]RoseRK，TurnerSJ．Fluoride-inducedenhancementofdiffusioninstreptococcalmodelplaquebiofilms．CariesRes．1998，32(3)：227-32．36 南京医科大学硕士学位论文【20]KaufmannM，BartholmesP．Purification，characterizationandinhibitionbyfluorideofenolasefromStreptococcusmutansDSM320523．CariesRes．1992，26(2)：110-6．[21]LynchE，BrauerDS，KarpukhinaN，GillamDG，HillRG．Multi—componentbioactiveglassesofvaryingfluoridecontentfortreatingdentinhypersensitivity．DentMater．2012，28(2)：168-78．37 南京医科大学硕士学位论文全文总结菌斑是龋病和牙周病的始动因子之一。人们为了控制口腔菌斑，常常采用机械方式，如刷牙、使用牙线，洁治等等。但由于口腔内情况复杂：牙体窝沟点隙较多，牙齿之间的排列不齐，个体张口度小等原因，使得无法使用机械方式彻底清除口内所有菌斑。因此，在机械方式的基础上，常会加入抗菌成分。理想抗菌剂的特点：1、能有效杀灭、抑制细菌及菌斑；2、不会引起染色和细菌耐药；3、无毒无味无刺激性，有良好的生物安全性；4、长期使用安全有效；5、成分更简单、更天然；6、在控制菌斑的同时，能够治疗其他口腔问题，如牙龈出血、牙本质过敏症等。科学家一直致力于寻找具有以上特点的理想抗菌剂，不断有新型抗菌成分被发现、检验并应用于临床。生物活性玻璃就是其中一种。它是由LarryHench教授于1969年发明的由无机成分组成的生物活性材料。能够有效治疗牙本质过敏症并具有一定再矿化作用，对早期龋有一定治疗作用。除此以外，其对多种口腔细菌具有杀菌效果。但有关其抗酸能力和对菌斑的抗菌效果则缺乏相关研究，本研究以此为基础，设计实施了第一部分实验。茵斑对抗菌剂抵抗性比游离细菌高出几十倍，因此除了增加抗菌剂剂量外，还会添加其他抗菌成分共同作用，以起到事半功倍的效果。究竟使用两种抗菌剂是否比单纯使用一种来的有效，联合应用与增加抗菌剂剂量到底如何选择，第二部分实验以这两个问题为中心展开。在两部分实验中，我们围绕生物活性玻璃抗菌性能这一临床重要课题，测定生物活性玻璃对多种细菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，得到不同浓度生物活性玻璃与细菌共同培养后的pH值，在体外模拟生成单菌种或多菌种菌斑38 南京医科大学硕士学位论文并在扫描电镜和激光共聚焦显微镜下对其超微结构进行观察研究。力求从不同角度探索生物活性玻璃对游离细菌和不同菌斑的抗菌效果，比较临床几种常用抗菌剂单独和联合使用的不同效果，寻找提高抗菌效果的最佳使用方式。经过研究，得出以下结论：l、生物活性玻璃对三种细菌的抑制能力依次为：粘性放线菌>变形链球菌>血链球菌，杀菌能力依次为：变形链球菌>血链球菌、粘性放线菌。由此可见，相对于变形链球菌和粘性放线菌，血链球菌对生物活性玻璃更不敏感。主要致龋菌变形链球菌则相对容易被抑制和杀灭。2、生物活性玻璃遇水快速溶解释放钙、钠等碱性离子，升高溶液pH值，中和部分酸性产物。本实验中1／4MIC的生物活性玻璃能在24h内保持溶液的pH>6。因此，生物活性玻璃溶解产生的高pH值溶液不仅能杀菌抑菌，亦能调节整个液体环境pH，降低牙体脱矿的风险。3、生物活性玻璃对菌斑有一定抑制和杀灭作用，使得24h单菌种和多菌种菌落变小，菌斑厚度变薄。这种作用随生物活性玻璃浓度的增加而增强。4、随着菌斑培养时间增加，使用抗菌剂后细菌数目的减少幅度越来越小，可见抗菌剂的抗菌作用随着菌斑的成熟而逐步减弱。5、生物活性玻璃与氟化钠、三氯生联合使用效果单独使用这三种抗菌剂的总效应增强136．43~464．16％。6、生物活性玻璃与氟化钠的联合使用对细菌的杀菌作用最为有效。而在渗透效果上，三氯生和生物活性玻璃联合应用略优于氟化钠和生物活性玻璃组。7、增加浓度能够增强抗菌效果。2MBC的生物活性玻璃、氟化钠、三氯生对比1MBC增强了l～14倍不等，但抗菌效应不及生物活性玻璃的联合应用。39 南京医科大学硕士学位论文生物活性玻璃的技术资料玻璃长久以来都被认为是一种惰性材料，然而，Hench教授于1969年改变了玻璃的组成和配比之后，玻璃变得有生物活性，能与水发生反应生成类羟基磷灰石物质，且具有诱导骨细胞增殖分化的生物作用。这种被称作“生物活性玻璃”的物质，一般组成为“CaO．Si02．P205”，部分添加“MgO、K20、Na20”等无机氧化物。在玻璃网络中非桥氧所连接的碱金属和碱土金属离子在水溶液中溶解释放金属离子，使得生物活性玻璃表面具有溶解性，非桥氧所占比例越大，玻璃的生物活性越高【l】。生物活性玻璃自身的组成决定了其具有高度生物活性以及可调节性，以满足不同的机械性和降解性的要求【2，引。生物活性玻璃主要应用是促进因创伤、肿瘤、先天疾病等导致的骨缺损的修复【4】，促进骨生长【51，促进伤口愈合‘61等，。在口腔方面主要应用于治疗牙本质过敏症、菌斑性龈炎、种植区域的骨支架材料、牙槽嵴增高，与胶原膜联合使牙周组织再生I7J等。生物活性玻璃的制作方法主要分为熔融法和溶胶．凝胶法。Hench教授最早用熔融法生产的45S5生物活性玻璃，具体是在>1000。C下高温熔融原料，然后再用低温淬火处理【8】。45S5生物活性玻璃因为具有较多网络外氧化物和双键结构，导致其化学活性较高【9J。溶胶．凝胶法则通过将Ca、P、Si水解成生物玻璃溶胶后再干燥处理，免去了过高的烧结温度，使得生产出的生物玻璃疏松多孔，比表面积比起熔融法来更大，生物活性也更高【l01。文献报导生物活性玻璃有抗菌特性，能够杀灭部分厌氧菌和需氧菌。主要抗菌机制是碱性离子使得溶液pH值升高，同时产生的高浓度离子渗透压使得细菌的正常结构破坏，导致细菌脱水【ll】。根据这一抗菌特性人们将生物玻璃加入牙膏中、手术缝线中【1羽、制成缓释载体稳定释放【13】，以此降低治疗中的感染风险。本研究所选用的生物活性玻璃材料，是一种熔融法制成的45S5生物活性玻璃粉体，主要由CaO、Si02、P205、Na20构成，白色无味，粒径小于909m。 南京医科大学硕士学位论文参考文献[1】和峰，刘昌胜．骨修复用生物玻璃研究进展．玻璃与搪瓷．2004，32(4)：54．58．[2】赵荻，黄文显．骨修复用生物玻璃复合材料研究进展．功能材料．2008，39(3)：353—354，357．【3】蔡玉荣，武军，周廉．生物玻璃材料研究进展．材料导报．2002，16(12)：40—42．【4】王砚军，陈长河，李冀．生物活性玻璃对骨缺损修复的研究新进展．实用骨科杂志．201l，17(4)：333．336．[5]杨玉生．生物活性玻璃对体外人成骨细胞生长周期的影响．中国组织工程研究与临床康复．2008，12(45)：8810．8814．【6】王钰，马兵，夏照帆，等．生物活性玻璃对30例烧伤患者治疗后期创面的疗效观察．中华烧伤杂志．2006，22(6)：474．[7】和红兵，段莉，欧炯光，等．生物活性玻璃与胶原膜引导牙周组织再生实验的临床研究．昆明医学院学报．2005，26(1)：33．37．[8】钟吉品．生物玻璃的研究与发展．无机材料学报．1995(02)．【9】张娟娟．新型生物活性玻璃的制备及其修复糖尿病大鼠难愈创面的研究．华南理工大学，2010：硕士，70．[10】Vallet-RegiM，RomanJ，PadillaS，DoadrioJC，GilFJ．BioactivityandmechanicalpropertiesofSi02-CaO—P205glass-ceramics．JournalofMaterialsChemistry．2005，15(13)：1353-1359．【11】StoorP，SoderlingE，SalonenJI．Antibacterialeffectsofabioactiveglasspasteonoralmicroorganisms．ActaOdontolScand．1998，56(3)：161-165．[12】PraaenJ，NazhatSN，BlakerJJ，BoccacciniAR．InvitroattachmentofStaphylococcusepidermidistosurgicalsutures、ⅣithandwithoutAg-containingbioactiveglasscoating．JBiomaterAppl．2004，19(1)：47—57．[13】秦荣毫．GM／BG体内外缓释及治疗兔感染性骨缺损的实验研究．泰山医学院，2011：硕士，61．41 南京医科大学硕士学位论文文献综述口腔常用抗菌斑制剂的研究进展摘要菌斑生物膜是致龋的关键因素之一，由于其复杂的结构和细菌状态的改变，使得抗菌剂不易对其发挥作用。多年来，氯己定、三氯生、氟、香精油等经过诸多临床研究，证实具有一定抑制菌斑，降低龈炎的效果。而新的抗菌斑制剂也在不断的发展壮大，并且投入到临床中使用。本文结合国内外最新研究进展，阐述了菌斑的形成和特点，回顾了非抗生素类抗菌斑制剂的研究状况、作用机理及其临床使用。关键词生物玻璃；生物活性玻璃；抗菌；菌斑口腔菌斑的形成及特点口腔内的生物环境为不同类型的微生物提供了生长和繁衍的有利条件【1捌。最大的微生物聚集是定植在牙表面的细菌生物膜，这些细菌可存在于任何暴露的牙面。口腔正常菌群能够防止外来微生物入侵，抵抗病原微生物在口腔内定植，以及调节由细菌导致的宿主炎性反应。干扰正常菌群的平衡会导致原本数目较少的细菌过度生长，或者使外界的致病菌在口腔中定植，由此增加患病风险。口腔内的正常有益菌不仅能够与宿主和平相处，更能够提供对组织的保护。因此在控制菌斑时，应尽量保留这些正常有益菌【3】。菌斑的组成结构依据细菌粘附的位置而不同，如窝沟，邻面，光滑表面，龈缘和义齿面等等。当菌斑处于一个相对密闭的环境时，就能保护自身不易被机械方式去除。牙菌斑的形成需要一个过程【4】：首先在刷牙后牙面上很快就形成一层获得性薄膜【5】，膜中主要含有10余种蛋白质、碳水化合物和脂肪。这层薄膜直接影响了特异性口腔微生物对牙面的附着，可以作为菌斑微生物的底物和营养。然后是细菌的附着：刚开始细菌和获得性薄膜的唾液糖蛋白之间的物理化学相互作用十分微弱，因此，这个阶段细菌对薄膜的粘附是可逆的。接着，细菌产生的粘附素与薄膜上的受体相结合，产生了强而不可逆的附着【6】。这些42 南京医科大学硕士学位论文早期的定植者持续增殖，改变微环境，同时产生多种粘附素，与宿主的大分子，以及其他细菌的感受器相结合，促进细菌自身的粘附，为后期厌氧菌细菌的粘附做准备。附着的细菌合成一些胞外聚合物，如葡聚糖。后期细菌的定植过程同样包括了粘附素和受体的结合，此时细菌的种类开始变得繁多，出现了不同的细菌形貌，如玉米穗形和玫瑰花形17]。多种细菌的共聚促进了菌斑中细菌以更有利方式形成一定结构。如果两种细菌之间互相影响新陈代谢，那它们相对于其他细菌有着更多的接触。比如，严格厌氧菌能够与耗氧细菌共聚来保证自身在有氧坏境下的活性。粘附完成后，粘附细菌开始增殖。细菌通过二分裂法增殖，同时产生可溶或者不可溶性的葡聚糖、果糖、多杂聚合物等胞外基质。这些基质是菌斑最普遍的特征，为菌斑提供了架构，同时增强了对外界环境的抵御。这些菌斑具有生物活性，能够保存营养，水和利于菌斑生长的酶类【8】。传统的观察方式让科学界认为菌斑的结构是紧密封闭的，而最新的显微技术则发现菌斑的结构相对开放。定植完成的细菌能够对外界刺激作出反应，并从菌斑表面分离出去，促进细菌在别处定植。部分固着细菌能够释放出水解酶水解锚定细菌的粘附素，从而促使这种分离发生。成熟的菌斑厚度较大，包括了多种多样的相互作用的细菌微生物及其产物。这些微生物互相拮抗，竞争和协作，形成了内部的动态平衡。菌斑的特性与组成菌斑的游离细菌有很大区别，其中一大特点就是对抗菌剂、压力、宿主防御有着更大的耐受能力，更难以清除【9】。菌斑就像一个小社区，其中的细菌能够与邻近的细菌相互影响，这种是游离细菌无法有的，菌斑中的细菌互相组织协调，就像一个社区一样。这种形式对于细菌来说有诸多好处：1从无氧到有氧不同程度的生存环境适于不同细菌的生长；2更有效地新陈代谢，如细菌能共同分解宿主复杂的大分子结构；3提高了对压力和抗菌剂的抵抗；4增强了毒力作用。当菌斑的内部平衡被打破，疾病也就产生了，新的致病菌斑与健康状态下的菌斑组成大不相同：原有的竞争力强的细菌减少了，取而代之的是原先数量43 南京医科大学硕士学位论文较少的细菌【l们。在龋病中，日常的碳水化合物摄取为菌斑提供了长时间的低pH环境，导致嗜酸和耐酸的细菌生长，如变形链球菌，乳杆菌，双歧杆菌等。酸性环境同时也抑制了正常有益菌的生长。在牙周疾病中，过多的茵斑堆积会引起游离龈的炎症反应。当宿主无法控制细菌入侵时，龈沟液就会增多，从而引起更大的宿主反应，包括了血红蛋白、结合珠蛋白、铁传递蛋白的增多。细菌的蛋白水解作用能够分解宿主调节炎症的分子，导致炎症的加重，增大对软组织的伤害。通过对牙周袋内细菌的培养研究发现，菌斑中细菌数目增大，有着更高比例的革兰阴性菌和严格厌氧菌，以及能够水解蛋白的细菌【11,12】。口腔疾病可以通过认真严格地机械清除菌斑来预防。但是，许多人在维护口腔卫生时有着不同程度的困难。所以亟需一种补充的清洁方法来辅助传统清洁，让菌斑的量维持在稳定范围。为此，很多口腔护理产品添加了抗菌斑和抗菌成分来加强对口腔卫生的维护。抗菌斑成分主要是防止菌斑生成，或者清除现有菌斑。抗茵成分的起效模式通常包括了通过MIC和MBC来抑制杀灭细菌。通常MIC和MBC是通过实验室在液体环境下针对游离细菌测定的。而细菌在表面形成菌斑以后对抗菌成分不再那么敏感，这一点在成熟菌斑中尤为明显。菌斑和游离细菌对抗菌剂的不同反应与菌斑结构有关，也与抗菌机制有关。具体原因有以下三点：l、抗菌剂与菌斑基质相结合，在菌斑表层即失效，无法渗透入菌斑深层。2、表层的细菌出现了新的显性基因表达。3、细菌缓慢的生长速度导致其对外界反应不敏感。临床研究中发现在物体表面附着的细菌对抗菌剂有着更大的的抵抗。举例来说，在导尿管上沉积的铜绿假单胞菌比起在液体环境下提高了500．1000倍对抗菌剂的抵抗【13J51。同样的，牙膏和漱口水中的抗菌剂也遇到了菌斑的强抵抗。远缘链球菌对氯己定和氟化胺类的抑菌浓度在菌斑中分别增加了300倍和75倍。类似的情况还有血链球菌，需要增加lO．50倍剂量的氯己定才能抑制24h血链球菌菌斑活性【16】。原位菌斑的激光共聚焦数据显示，氯己定只能影响24h和48h菌斑的最外层细菌。口腔中的细菌对阿莫西林、强力霉素和甲硝唑等抗 南京医科大学硕士学位论文生素的抵抗则更强【17,18】。比起抵抗，抵抗背后的机制更jJn01人深思。药物的作用目标，如输出泵，酶修饰等，常常会产生变异。在菌斑表面即使本来对药物敏感的细菌也能在这些变异下提高自身的耐受力，且菌斑内部的基因会相应发生同样的基因改变，以此提高整体菌斑的耐受性。变异的结果是药物作用的目标改变，抑菌效应无法表达，或者细菌本身采取不同的代谢策略，使得抗菌药物的作用变得微弱。另一种机制是茵斑本身的结构限制了抗菌药物的渗透，一些带有电荷的抗菌剂能够与带有相反电荷的细菌基质结合，也能与细菌本身结合，抑制菌斑表面的细菌，但是对于深层的细菌则失去了抑制和杀灭能力。细菌是倚赖营养生长繁殖的，而在营养相对较少的菌斑中，生长和增殖速度都相应减慢，这也是影响深层细菌对药物敏感性的重要原因之一。抗菌斑制剂氯己定氯己定(Chlorhexidine)，别名洗必泰，化学名1,6．双一(N．对氯苯双胍)己烷，简称双氯苯双胍己烷，属于有机阳离子抗菌剂，常用于对皮肤、黏膜的消毒，对口腔常见的革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌也有一定抑制和杀灭能力，属于一种广谱杀菌剂。目前氯己定的类型主要包括：葡萄糖酸氯己定，醋酸氯己定，盐酸氯己定等等。是口腔中最为常用的抗茵制剂。主要以漱口水，牙膏，保护漆，喷雾，冲洗液等形式出现。其优点主要体现在性质稳定、低毒性、长期使用不易产生耐药菌株。氯己定在口腔临床已经使用了四十多年，主要用于降低龈炎，菌斑和牙龈出血。氯己定作为一个阳性的离子，与带有负电荷的细菌细胞壁结合，在低浓度(O．02％-0．06％)下，改变细胞壁的渗透平衡，促进钾和磷离子的释放【19】。在高浓度(0．12％---0．2％)下引起细胞溶解，提高细菌细胞膜的渗透性，改变了细菌45 南京医科大学硕士学位论文的蛋白结构，导致细胞质蛋白质的凝集反应。这种抗菌效应对革兰阳性细菌更为有效，同时对霉菌等也有中等程度的抗菌效果，但是对病毒和能耐受酒精的芽孢杆菌无效。氯己定能够长时间附着在组织粘膜上，达到一个长久地抗菌效果(约8．12h)[201，同时氯己定能够与形成唾液蛋白膜的粘液素相结合，缓慢地释放并取代唾液腺中的钙离子，由此减少了细菌的定植【21丑】。使用氯己定漱口液对抗菌斑和龈炎的效果显著优于安慰剂组，副作用是牙齿和粘膜染色以及口感偏苦【23，241。长期的临床实验表明氯己定能够有效预防和控制菌斑形成，破坏已形成的菌斑，降低龈炎的发生率【251。由于其能够强力粘附在粘膜上，因而进入胃肠道的量较少，从而呈现低毒性[261。美国FAD(FoodandDrugAdministration)和ADA(AmericanDentalAssociation)认证，含有O．12％氯己定的漱口水被认为能够有效控制菌斑和龈炎。三氯生三氯生(Triclosan)，学名“二氯苯氧氯酚”，化学分子式为C12H7C1302，又名“三氯新”、“三氯沙”等，三氯生常态为白色或灰白色晶状粉末，稍有酚臭味。不溶于水，易溶于碱液和有机溶剂。是一种广谱抗细菌和真菌的制剂【27】，此外，三氯生还对腺病毒、流感病毒、疫苗病毒和乙肝病毒表面抗原等多种病毒也有明显的抑制作用【28】，常被加入到抗菌皂，牙膏，织物和塑料中。自19世纪70年代Ciba发明三氯生以来，诸多关于三氯生的临床研究都证实三氯生能够有效杀灭革兰阳性菌和革兰阴性菌‘291。对于大肠杆菌，三氯生主要通过转变或过表达编码烯酰还原酶的fabI基因，来阻断脂质合成。亦能抑制合成蛋白的F(H+)．ATPase，提高完整细菌胞膜的渗透性。除此之外，能够与带有弱酸性的跨膜质子载体(如氟，山梨酸酯)抑制糖酵解从而抑制产酸。即使在中性的pH下，三氯生也能直接抑制糖酵解。如在pH=7时，0．1mmol／L的三氯生能够抑制游离菌和细菌膜的糖酵解，这个浓度也可以使变形链球菌失去活性㈨。 南京医科大学硕士学位论文变形链球菌中缺乏了fabI基因，三氯生是如何使其失活的呢?研究表明对PTS(sugarphosphotransferasesystem，磷酸转移酶系统)的抑制是三氯生主要的杀菌方式，特别是丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶、缩醛酶等，对于三氯生尤为敏感【3l】。Hall等【321发现在使用含有三氯生的牙膏刷牙之后12h，菌斑中仍能检测到0．03mmol／L的三氯生，由此可见三氯生能够长时间停留在菌斑中，延长与细菌作用时间。总体来说三氯生对于变形链球菌等缺乏fabI基因的细菌，通过多点抑制的方式来抑制菌斑中的糖酵解，同时三氯生可以在菌斑中存留，持续降低患龋风险。多项动物实验表明，长期使用三氯生对于人体并无不良反应，其安全性有所保障【331。在牙膏中的浓度一般为O．3％，高露洁棕榄公司所研发的乙烯基甲醚．马来酸酐共聚物，能够提高三氯生在牙表面的持久性，达到持续刷牙后12h抗菌的功效[34,35】。根据此成分，高露洁研发了第一款由FDA(FoodandDrugAdministration，美国食品药物管理署)认证的能够预防龋病、菌斑和龈炎的牙膏——高露洁全效【361。氟氟(Fluoride)是一种常见的化学物质，在地壳基本元素中排名第十三位。氟在龋病的预防中起到了重要作用：日常生活中，人们主要是接触含氟的饮水，食物，或者牙膏等制剂，来达到预防龋病的目的。关于饮水氟化是否会造成氟中毒的讨论一直延续至今，有些地方取消了饮水氟化，如荷兰，有些地方减少了氟的添加量，如香港。幸运的是，相比无法调整的饮水含氟量，我们可以在口腔产品中加入氟来满足不同个体的需求。氟离子抗龋的机制是十分复杂的，包括了矿化和与细菌作用的阶段。氟可以和牙齿或者骨骼结合，在表面生成氟磷灰石。比起羟基磷灰石，氟磷灰石更不易在酸性环境中溶解，由此更能抵御细菌产酸对釉质的破坏，达到抗龋目的。除了对于钙化牙体的保护作用外，亦能够减少变形链球菌等的酸性产物形47 南京医科大学硕士学位论文成。Oliveby等【37】发现高浓度的氟能够在菌斑中抑制细菌产酸，特别是变形链球菌等致龋菌，从而降低菌斑致龋的可能性。对于敏感的细菌，氟能够通过抑制烯醇酶活性抑制糖酵解。烯醇酶是参与EMP(Embden—Meyerhof—PamasPathway，埃姆登．迈耶霍夫)途径的酶之一，负责将2．磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸。抑制了烯醇酶的活性就抑制了磷酸烯醇式丙酮酸的胞内含量，同时抑制了PTS(磷酸转移酶系统)从而降低糖的摄取。更深层次的影响是氟直接影响了与膜相关的质子运输泵I-i+．ATPase。有研究发现在加入氟化钠后，唾液链球菌中的磷酸烯醇式丙酮酸和ATP含量下降，同时2．磷酸甘油酸的含量增加p引。另一个氟的特性是能够弱化产酸。氟增大了胞膜的穿透性，使F．ATPase不停协助输出离子，从而导致细胞质的酸化，抑制了糖酵解酶产酸【391。临床实验表明，每天使用2％的氟化钠溶液可以使菌斑内的pH值下降0．5t401。另有学者发现，在使用1．3周1％氟化钠凝胶后，菌斑中的由蔗糖分解产生的乳酸产物量下降了60％t4¨。但又有学者发现，氟在细胞质中与蛋白质的结合是不稳定的，轻度的酸化即能使之分离【421。由于目前尚无能够准确测定菌斑中与细菌结合的氟量，故有多少氟能够参与细胞质酸化过程仍不得而知。常见用氟形式：氟化亚锡、单氟磷酸钠、氟化钠。香精油香精油(EssentialOil)，或称挥发性油，是植物所产生的一种挥发的芳香油状物。大部分在室温下是水状的，少数呈固体或者脂状。颜色各不相同。他们是从植物的各个器官中(种子，花，叶子，茎，果实，根等)通过科技手段提取而成，这些手段包括了蒸馏，溶剂萃取，水萃取等等。在埃伯特的纸莎草纸中就有记载超过800种香精油的治疗作用，其中没药颇受欢迎，常与蜂蜜和其他植物混在一起，共同抑制细菌生长[43,441。香精油主要包含了萜烯、萜类化合物、芳香和脂类成分。大部分的抗菌活性来自含氧萜类化合物(如酒精和酚类化合48 南京医科大学硕士学位论文物)，部分烃类也能产生抗菌作用。香精油的一大特点就是疏水性，这个特性使它们更容易将脂质从细胞膜中分离，干扰细胞结构，增加胞膜穿透性。然后细胞内离子及其他成分游离出细胞外，一旦超过细胞所能承受的限度，将会导致细胞死亡【45‘471。Gustafsont481的实验中，经过茶树精油的作用，大肠杆菌在细菌溶解前就已死亡。香精油亦对细胞质膜上的蛋白质分子起作用，如ATP酶。可能的机制是香精油的亲脂碳氢分子能够在脂质双分子层中积聚，直接或间接影响ATP酶和脂质的相互作用【49】。用于口腔类的香精油有薄荷脑、百里香酚、桉树脑等，常被添加入牙膏和漱口水中。多项临床研究表明，香精油能够抑制菌斑，减轻牙龈炎症，同时其香味能够改善口气【50·521。生物活性玻璃生物活性玻璃(BioactiveGlass)由LarryHench教授在1969年发明。其成分主要包括了氧化钙，氧化钠，五氧化二磷和二氧化硅，这四种无机成分为材料本身提供了表面活性，能与骨产生有力结合。生物活性玻璃刚发明的时候主要是修复骨缺损，在口腔方面，可用作颌面部骨缺损的替代品，修复牙槽骨的缺损，帮助牙周组织的再生。近年来，生物活性玻璃被用来治疗牙本质过敏症，并且取得了商业上的成功【531。其主要机理是生物活性玻璃遇水能够快速溶解，释放硅离子，在牙齿表面形成凝胶层，随后钙磷沉积其中封堵牙本质小管。有研究表明在每天涂刷三次生物活性玻璃，连续7天之后，能够在牙釉质表面观察到同样密度的类羟基磷灰石层覆盖【541。此外，添加生物活性玻璃的商品凝胶已通过FDA认证，能够治疗暴露牙本质的敏感症状。杜民权【55】等进行的实验性研究得出含有生物活性玻璃的牙膏治疗牙本质过敏症的效果显著优于安慰剂。有实验证明其对多种细菌具有杀菌效果，不仅包括了常见致病菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，亦包括了口腔特有需氧菌和厌氧菌撑，如血链球菌、伴放线放线杆菌、牙龈卟啉单胞菌等【56】。49 南京医科大学硕士学位论文生物活性玻璃表现出快速有效的抗茵特性。快速地遇水溶解产生碱性离子被认为是杀菌的关键机制，这一过程包括了渗透压的升高和pH值的快速增加【571。不同种类的生物活性玻璃有着不同的比表面积，比表面积越高，其溶解速度越快，杀菌也就越迅速。$53P4比表面积为1920cm～，另一个实验中所用的生物活性玻璃颗粒比表面积为0．4cm～，二者的离子释放速度在60分钟内相差300倍，同时，在60分钟内$53P4粉末的pH从7升至11，颗粒溶液的pH仅从7升至9t581。很多异养细菌能耐受0．75％的渗透压，但无法在高于1％渗透压下生长。口腔链球菌是个例外，多种链球菌在5％蔗糖环境仍然能够增殖。Stoor[58】等测定了$53P4遇水后10min的离子渗透压，约为3％，在60min达到4％。因此渗透压对细菌的影响仍值得进一步探讨。Gubler【59】的一项实验证明，在牙面上有细菌粘附的前提下放入生物活性玻璃，反应一段时间后冲洗摄片，发现牙片上既无再矿化的类羟基磷灰石物质，也无细菌粘附。可见生物活性玻璃在接触细菌时并无再矿化作用，析出的离子连续地影响细菌的代谢，最终导致细菌溶解破裂。除了pH值和渗透压升高以外，生物活性玻璃还有其他杀菌方式，用透射电镜(TEM)观察生物活性玻璃处理过的大肠杆菌时可见，生物活性玻璃所产生的大量针状玻璃簇能够刺破大肠杆菌的细胞壁，导致细胞破裂。另有少量玻璃簇也粘附在细菌壁上，干扰细胞膜的结构，增加胞膜渗透性【60】。众所周知，银离子能够抗菌，而且可以容易地添加入玻璃(用银取代钠)，然后在溶解的过程中释放出来。第一个载银生物玻璃是通过溶胶凝胶法合成的，质量分数分别为：76％S102,19％CaO，2％P205和3％A920。在这些实验中，比起不含银离子的50mg／ml的生物玻璃(可能有毒性)的杀菌效果，只需要1、O．5和O．5mg／ml的生物玻璃溶于溶液即可分别杀灭大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。重要的是，这类低浓度的溶胶凝胶生物玻璃对人体成骨细胞没有任何毒性i61,62J。50 南京医科大学硕士学位论文生物活性玻璃抗菌的特性能够在种植时防止细菌的入侵，帮助形成骨结合。由于生物活性玻璃不含氟的特点，其制品已经在儿童口腔保健领域获得了商业上的成功。市售牙膏中生物活性玻璃的浓度从5‰10％不等。参考文献[1】AasJA，PasterBJ，StokesLN，OlsenI，DewhirstFE．Definingthenormalbacterialfloraoftheoralcavity．J．Clin．Microbi01．2005；43：5721-32．【2】2ZauraE，KeijserBJ，HuseSM，CrielaardW．Definingthehealthy”coremicrobiome”oforalmicrobialcommunities．BMCMicrobi012009；9：259．[3】MarshPD．Microbiologicalaspectsofthechemicalcontrolofplaqueandgingivitis．J．Dent．Res．1992；71：1431-8．[4】MarshPD，MoterA，DevineDA．Dentalplaquebiofilms：communities，conflictandcontr01．Periodont01．20002011；55：16-35．[5]A1-HashimiI，LevineMJ．Characterizationofinvivosalivary—derivedenamelpellicle．Arch．OralBi01．1989；34：289-95．[6】JenkinsonHF，LamontRJ．Streptococcaladhesionandcolonization．CritRevOralBiolMed1997；8：175-200．【7】KolenbranderPE．Oralmicrobialcommunities：biofilms，interactions，andgeneticsystems．AnnuRevMicrobi01．2000；54：413-37．[8】AllisonDG．Thebiofilmmatrix．Biofouling2003；19：139·50．[9】SocranskySS，HaffajeeAD．Dentalbiofilms：difficulttherapeutictargets．Periodont01．20002002；28：12-55．【10】MarshPD．Aredentaldiseasesexamplesofecologicalcatastrophes?Microbiology+2003；149：279-94．[11】SocranskySS，HaffajeeAD，CuginiMA，SmithC，KentRJ．Microbialcomplexesinsubgingivalplaque．J．Clin．Periodont01．1998；25：134-44．51 南京医科大学硕士学位论文[12】SocranskySS，HaffajeeAD．Periodontalmicrobialecology．Periodont01．20002005；38：135—87．[13】GilbertP，DasJ，FoleyI．Biofilmsusceptibilitytoantimicrobials．AdvDentRes1997；11：160-7．【14】GilbertP，Maira-LitranT，McBainAJ，RickardAH，WhyteFW．Thephysiologyandcollectiverecalcitranceofmicrobialbiofilmcommunities．Adv．Microb．Physi01．2002；46：202—56．[15]CeriH，OlsonME，StremickC，ReadRR,MorckD，BuretA．TheCalgaryBiofilmDevice：newtechnologyforrapiddeterminationofantibioticsusceptibilitiesofbacterialbiofilms．J．Clin．Microbi01．1999；37：1771．6．[16】MillwardTA，WilsonM．TheeffectofchlorhexidineonStreptococcussanguisbiofilms．Microbios1989；58：155．64．[17】LarsenT．SusceptibilityofPorphyromonasgingivalisinbiofilmstoamoxicillin，doxycyclineandmetronidazole．OralMicrobiolImmunol2002；17：267．71．【18】LarsenT，FiehnNE．ResistanceofStreptococcussanguisbiofilmstoantimicrobialagents．Apmis1996；104：280．4．[19]PuigSM，MontielCJ，AlmerichSJ．Useofchlorhexidinevarnishesinpreventingandtreatingperiodontaldisease．Areviewoftheliterature．MedOralPatolOralCirBucal2008；13：E257-60．[20]BonesvollP．Oralpharmacologyofchlorhexidine．J．Clin．Periodont01．1977；4：49-65．[21】GreensteinG，BermanC，JaffinR．Chlorhexidine．Anadjuncttoperiodontaltherapy．J．Periodont01．1986；57：370—7．[22】ChenY，WongRW，SeneviratneCJ，HaggU，McGrathC，SamaranayakeLP．ComparisonoftheantimicrobialactivityofListerineandCorsodylonorthodonticbracketsinvitro．AmJOrthodDentofacialOrthop2011；140：537．42．52 南京医科大学硕士学位论文[23】VanStrydonckDA，SlotDE，VanderVeldenU，VanderWeijdenF．Effectofachlorhexidinemouthrinseonplaque，gingivalinflammationandstainingingingivitispatients：asystematicreview．J．Clin．Periodont01．2012；39：1042．55．【24】FlotraL，GjermoP，RollaG，WaerhaugJ．Sideeffectsofchlorhexidinemouthwashes．ScandJDentRes1971；79：119—25．[25】MarshPD．Controllingtheoralbiofilm谢thantimicrobials．J．Dent．2010；38Suppl1：S11-5．[26】FoulkesDM．Sometoxicologicalobservationsonchlorhexidine．JPeriodontalResSuppl1973；12：55-60．【27】BhargavaHN，LeonardPA．Triclosan：applicationsandsafety．Am．J．Infect．Control1996；24：209—18．[28】DellannoC，VegaQ，BoesenbergD．Theanfiviralactionofcommonhouseholddisinfectantsandantisepticsagainstmufinehepatitisvirus，apotentialsurrogateforSARScoronavirus．Am．J．Infect．Control2009；37：649—52．[29]RegosJ，HitzHR．InvestigationsonthemodeofactionofTriclosan，abroadspectrumantimicrobialagent．ZentralblBakteriolOrigA1974；226：390-401．【30】McMurryLM，OethingerM，LevySB．Triclosantargetslipidsynthesis．Nature1998；394：531-2．【31】PhanTN，MarquisRE．TriclosaninhibitionofmembraneenzymesandglycolysisofStreptococcusmutansinsuspensionsandbiofilms．Can．J．Microbi01．2006；52：977-83．【32】HallPJ，GreenAK，HorayCP，deBrabanderS，BeasleyTJ，CromwellVJ，eta1．Plaqueantibacteriallevelsfollowingcontrolledfoodintakeanduseofatoothpastecontaining2％zinccitrateand0．3％Triclosan．Int．Dent．J．2003；53：379．84．[33】BhargavaHN，LeonardPA．Triclosan：applicationsandsafety．Am．J．Infect．ControlI996；24：209．18．53 南京医科大学硕士学位论文[34】GaffarA，AffiittoJ，NabiN，HerlesS，KrugerI，OlsenS．Recentadvancesinplaque，gingivitis，tartarandcariespreventiontechnology．Int．Dent．J．1994；44：63-70．[35】VolpeAR，PetroneME，DeVizioW，DaviesRM．Areviewofplaque，gingivitis，calculusandcariesclinicalefficacystudieswithadentifricecontainingtriclosanandPVM／MACopolymer．JClinDent1993；4SpecNo：31—41．[36】FDAdocument，FoodandDragAdministration，NDA20-231，July11，(1997)anditsseriesofsupplemen-talapprovalsinthefollowingyears．[37】A1一TannirMA，GoodmanHS．Areviewofchlorhexidineanditsuseinspecialpopulations．SpecCareDentist1994；14：116—22．[38】KanapkaJA，HamiltonIR．Fluorideinhibitionofenolaseactivityinvivoanditsrelationshiptotheinhibitionofglucose-6一PformationinStreptococcussalivarius．Arch．Biochem．Biophys．1971；146：167·74．[39]MarquisRE．Diminishedacidtoleranceofplaquebacteriacausedbyfluoride．J．Dent．Res．1990；69SpecNo：672-5；discussion682-3．[40】WoolleyLH，RicklesNH．Inhibitionofacidogenesisinhumandentalplaqueinsitufollowingtheuseoftopicalsodiumfluoride．Arch．OralBi01．1971；16：1187-94．[41]BrownLR，WhiteJO，HortonIM，DreizenS，Streckfuss儿．Effectofcontinuousfluoridegeluseonplaquefluorideretentionandmicrobialactivity．J．Dent．Res．1983；62：746—51．【42】OphaugRH，JenkinsGN，SingerL，KrebsbachPH．Aciddiffusionanalysisofdifferentformsoffluorideinhumandentalplaque．Arch．OralBi01．1987；32：459—61．[43】VandeBraak，S．A．A．J．；Leijten，GC．J．J．EssentialOilsandOleoresins：ASurveyintheNetherlandsandOtherMajorMarketsintheEuropeanUnion；TheNetherlands，CBI，CentreforthePromotionofImportsfromDevelopingCountries：RotterdalTl，1999；116． [44】Balz，R．TheHealingPowerofEssentialOils，1sted．；USA，LotusPress：TwinLakes，WI，1999；27-80．【45】SikkemaJ，deBontJA，PoolmanB．Interactionsofcyclichydrocarbonswithbiologicalmembranes．J．Bi01．Chem．1994；269：8022．8．[461UlteeA，BennikMH，MoezelaarR．Thephenolichydroxylgroupofcarvacrolisessentialforactionagainstthefood-bornepathogenBacilluscereus．ApplEnvironMicrobiol2002；68：1561—8．【47】CarsonCF，MeeBJ，RileyTV．MechanismofactionofMelaleucaaltemifolia(teatree)oilonStaphylococcusaureusdeterminedbytime-kill，lysis，leakage，andsalttoleranceassaysandelectronmicroscopy．AntimicrobAgentsChemother2002；46：1914—20．【48】GustafsonJE，LiewYC，ChewS，MarkhamJ，BellHC，WyllieSG，eta1．EffectsofteatreeoilonEscherichiacoli．Lett．Appl．Microbi01．1998；26：194．8．[49】SikkemaJ，deBontJA，PoolmanB．Mechanismsofmembranetoxicityofhydrocarbons．MicrobiolRev1995；59：201．22．【50】JavedF，A1-HezaimiK，RomanosGE．Roleofdentifrices丽t11essentialoilformulationsinperiodontalhealing．Am．J．Med．Sci．2012；343：411-7．【51】CoelhoJ，KohutBE，MankodiS，Parikh＆WuMM．Essentialoilsinanantiplaqueandantigingivitisdentifrice：a6-monthstudy．Am．J．Dent．2000；13：5C-10C．[52】StoekenJE，ParaskevasS，vanderWeijdenGA．Thelong．termeffectofamouthrinsecontainingessentialoilsondentalplaqueandgingivitis：asystematicreview．J．Periodont01．2007；78：1218．28．【53】JonesJR．Reviewofbioactiveglass：fromHenchtohybrids．ActaBiomater2013；9：4457．86．[54】DongZH，ChangJA，ZhouY，LinKL．Invitrorcmineralizationofhumandental55 南京医科大学硕士学位论文enamelbybioactiveglasses．3．Mater．Sci．2011；46：1591-1596．[55】DuMinQ，BianZ，JiangH，GreenspanDC，BurwellAK，ZhongJ，TaiBJ．Clinicalevaluationofadentifricecontainingcalciumsodiumphosphosilicate(novamin)forthetreatmentofdentinhypersensitivity．AmJDent．2008；21：210-4．[56】AllanI，NewmanH，WilsonM．Antibacterialactivityofparticulatebioglassagainstsupra—andsubgingivalbacteria．Biomaterials2001；22：1683-7．【57】ZhangD，LepparantaO，MunukkaE，YlanenH，ViljanenMK，EerolaE，eta1．Antibacterialeffectsanddissolutionbehaviorofsixbioactiveglasses．JBiomedMaterResA2010；93：475·83．[58】StoorP，SoderlingE，SalonenJI．Antibacterialeffectsofabioactiveglasspasteonoralmicroorganisms．ActaOdont01．Scand．1998；56：161—5．【59】GublerM，BrunnerTJ，ZehnderM，WaltimoT，SenerB，StarkWJ．DobioactiveglassesconveyadisinfectingmechanismbeyondamereincreaseinpH?Int．Endod．J．2008；41：670-8．[60】HuS，ChangJ，LiuM，NingC．Studyonantibacterialeffectof45S5Bioglass．JMaterSciMaterMed2009；20：281-6．[61】BellantoneM，ColemanNJ，HenchLL．Bacteriostaticactionofanovelfour-componentbioactiveglass．J．Biomed．Mater．Res．2000；51：484·90．【62】BellantoneM，WilliamsHD，HenchLL．Broad-spectrumbactericidalactivityofAg(2)O—dopedbioactiveglass．AntimicrobAgentsChemother2002；46：1940-5．56 南京医科大学硕士学位论文攻读学位期间发表文章情况序号文章题名、刊物名称、卷期号、起讫页码、发表时间排名状态生物活性玻璃对致龋菌及龈上菌斑的抗菌效果研究，1已发表口腔医学，2014，34(3)：167．170AntimicrobialeffectsofBioacfiveGlasswithFluorideor2l已投稿TriclosanonStreptococcusMutansBiofilm57 南京医科大学硕士学位论文致谢三年的研究生生活即将落下尾声，在这三年里，有奋斗，精彩和欢笑，也有迷茫，失落和泪水。感谢一路陪伴的人，在不停歇的时光里，教会我成长的道理。让我在南京这个陌生城市，感受到熟悉亲切的温暖。我要感谢导师陈亚明教授，在这三年中，他关心着我的学习和生活，扩大了我在专业上的知识层面和眼界，给我提供了诸多锻炼的机会。他的言传身教让我受益匪浅。本论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成的，他的鼓励和鞭策是我前进路上的动力。我要衷心感谢章非敏老师、王国平老师、吴凤鸣老师、张怀勤老师、顾卫平老师、陈岗老师、张栋华老师、胡建老师等，他们对我的科研、临床及论文撰写等各方面都给予了悉心指导和无私帮助。科研是我研究生生涯的重要组成部分，非常感谢口腔研究所的于金华老师、杨迷芳老师、郑阳玉老师、王子露老师在我实验过程中提供了指导和支持，还要感谢中国科学院古生物研究所的方艳老师，北京大清生物技术有限公司研发部的翟晖经理，香港大学牙科学院的梅蕾老师，课题的顺利进展离不开他们热情的帮助。我还要感谢王琛、嵇颖辰、武琼、冯颢、史舒雅、杨雪、王梦婷、董菁杰、丁亚娟、王婕和罗瑞等同门，他们的陪伴和帮助给我带来了温暖和力量，我们是永远的兄弟姐妹。感谢三年中陪伴在我身边的同学、朋友，感谢他们为我提出的有益的建议和意见，有了他们的支持、鼓励和帮助，我才能充实地度过了三年的学习生活。最后要特别感谢我的父母，他们一直用强大的内心支持和包容着我，也因此我有足够的信心和能力战胜前进路上的艰难险阻。焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报。青春如同奔流的江河，一去不回来不及道别，三年后的今天，我们就要各58 南京医科大学硕士学位论文奔前程。每个人的选择和道路不一样，但母校潜移默化的影响，对母校深深的眷恋，却将长久地伴随我们。“博学至精，明德至善”，南医的校训我将永远铭记在心。59