前列腺素脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

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1、中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（５）：４１～４５前列腺素脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定１１１１２１李美宁解军常冰梅张悦红殷云勤程牛亮（１山西医科大学生物化学与分子生物学教研室太原０３０００１）（２山西医科大学第一医院消化检验中心太原０３０００１）摘要１５?羟基前列腺素脱氢酶（ＰＧＤＨ）属于抑癌基因，在多种肿瘤中表达缺失，在肿瘤的发生发展中起着重要作用。提取人正常大肠黏膜组织总ＲＮＡ，利用ＲＴ?ＰＣＲ方法扩增得到ＰＧＤＨ基因的编码序列，克隆入原核表达载体ｐＢ

2、Ｖ２２０，测序鉴定正确后转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α，经温控诱导表达，表达产物进行ＳＤＳ?ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，证实为相对分子质量约为２９０００的ＰＧＤＨ?Ｈｉｓ６蛋白，表达２＋产物以包涵体形式存在，３ｈ诱导表达量最高，约占菌体总蛋白的３０％。经Ｎｉ配体亲和层析纯化得到纯度大于９５％的目的蛋白。重组ＰＧＤＨ简单复性后具有一定的生物活性，约为３．７×４１０Ｕ／ｍｇ，为下一步研究其在肿瘤中的作用奠定了基础。关键词大肠癌１５?羟基前列腺素脱氢酶克隆原核表达中图分类号Ｑ７８６ＮＡＤ＋依赖的１５?羟基前列

3、腺素脱氢酶（ＮＡＤ＋实验室保存；Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；反转录试剂盒、?ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ１５?ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＰＧＤＨ）是克隆质粒ｐＭＤ１８?Ｔ、限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＬＡＴａｑ前列腺素（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，ＰＧｓ）和相关的二十烷类生物活性酶及胶回收试剂盒均购自ＴａＫａＲａ公司；Ｔｒｉｓ碱、Ｔ４物质降解、灭活的关键酶，可催化有活性的１５?羟基前列腺ＤＮＡ连接酶、蛋白酶抑制剂和琼脂糖购自Ｐｒｏｍｅｇａ公素氧化成为

4、活性较弱的１５?酮基前列腺素。近来研究显示，司；溶菌酶购自Ｍｅａｒｋ公司；Ｈｉｓ?Ｔａｇ鼠单克隆抗体购自１５?ＰＧＤＨ的表达缺失或减少可能与一些恶性肿瘤，如肠ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌等的发生、发展密切相关［１，２］，和ＳＤＳ购自Ｓｉｇｍａ公司；低相对分子质量蛋白标准购自恢复其表达则对肿瘤的生长、转移有一定的抑制作用，如：华美公司；胰化蛋白胨和酵母提取物购自Ｏｘｏｉｄ公司；肺腺癌Ａ５４９细胞转染表达ＰＧＤＨ后裸鼠致瘤能力明显降２＋３Ｎｉ?ＮＴＡ树

5、脂柱购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司；１５（Ｓ）?［１５?Ｈ］低［３］；转染ＰＧＤＨ能诱导乳腺癌细胞凋亡［４］等。目前国ＰＧＥ２购自Ｃａｙｍａｎ公司；ＥＣＬ发光试剂购自碧云天生外关于ＰＧＤＨ的研究多为生物学特性及功能方面，国内有物技术研究所；其它试剂均为国产分析纯试剂。关ＰＧＤＨ研发的报道亦不多见。１．２ＰＣＲ引物设计与合成本研究克隆了ＰＧＤＨ蛋白基因，构建了ｐＢＶ２２０?根据ＰＧＤＨ的ｃＤＮＡ序列，利用ｐｒｉｍｅｒ５．０设计如ＰＧＤＨ?Ｈｉｓ６原核表达系统，建立了稳定的表达菌株，成下引物：上游引物为：５′?ＴＧ

6、ＣＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧ功获得目的蛋白，表达量达３０％，并具有一定的活性，ＣＡＣＣＡＴＧ?３′（含ＢａｍＨＩ酶切位点），下游引物为：５′?为下一步ＰＧＤＨ功能研究及药物开发奠定基础。ＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴ１材料与方法ＴＴＧＴＴＧＡＡＡＴＧＧＣ?３′（含ＰｓｔＩ酶切位点）。ＡＴＧ为起始密码子；５′ＴＧＣ为保护序列；下游引物含６个Ｈｉｓ序１．１材料宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α和原核表达载体ｐＢＶ２２０为本列，其余为外源基因序列。引物由上海生工

7、生物工程技术服务有限公司合成。收稿日期：２００７１１２９修回日期：２００８０１２４山西省科技攻关资助项目（２００６０３１０８７?０２）１．３总ＲＮＡ的提取与ＲＴ?ＰＣＲ通讯作者，电子信箱：ｃｈｅｎｇｎｉｕｌｉａｎｇｔｙ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ用Ｔｒｉｚｏｌ一步法从正常人大肠黏膜组织中提取总４２中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．２８Ｎｏ．５２００８ＲＮＡ，以ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物进行反转录，然后以上述引物１．７Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定进行ＰＣＲ扩增：１０×ＬＡＴａｑ

8、ｂｕｆｆｅｒ５μｌ、ｄＮＴＰ５μｌ、上游取５０μｇ样品与等体积的２×上样缓冲液混匀，引物１μｌ、下游引物１μｌ、ＬＡＴａｑ酶（５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、模板１００℃煮沸５ｍｉｎ，１２％ＳＤＳ?ＰＡＧＥ分离蛋白，转移至硝１０μｌ、灭菌去离子水２７．５μｌ。扩增程序为：９５℃预变性酸纤维素膜上，５％的脱脂奶粉?ＰＢＳ?０．０５％Ｔｗｅｅｎ?２０室５ｍｉｎ，９５℃变性３０ｓ，５４℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共温封闭２ｈ，加入以封闭液１∶５００