hhgf促进人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化实验的研究论文

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1、第三军医大学硕士学位论文hHGF促进人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的实验研究摘要我国有9300万的乙型肝炎病毒携带者，其中2千万人为乙肝患者，酒精性肝病及非酒精性肝病的发病率亦逐年升高，众多慢性肝脏损伤因素导致纤维结缔组织异常增生，引起肝功能失代偿、肝腹水、肝癌、上消化道出血等一系列严重并发症，药物难以医治，肝移植是目前治疗终末期肝病最为有效的方法，但困于肝源缺乏等问题，极大的限制了其临床应用，骨髓间充质干细胞因其无限增殖及多向分化的潜能，有望成为治疗终末期肝病的又一可行方法，并已成为研究热点。源于中胚层的骨髓间充质干细胞具有极强的可塑造性，多项研究

2、表明，其可分化为三个胚层的细胞，如成骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞等。在急慢性肝病中，移植骨髓间充质干细胞进行临床治疗已经在多篇文献中报道，且有多项实验已在动物体内或体外诱导过程中加入各种生长因子，以达到提高干细胞移植疗效的目的，目前尚缺乏转染基因后的骨髓间充质干细胞在体外诱导成肝样细胞的实验研究。有研究表明肝细胞生长因子（HGF）为骨髓间充质干细胞向肝细胞分化最重要的[8]始动因子之一，HGF作用的发挥同细胞膜受体c-met的结合密不可分。HGF蛋白与其受体c-Met结合后导致c-Metβ链的酪氨酸Tyr-1234及Tyr-1235残基

3、自身磷酸化，由此激活了受体内在的酪氨酸激酶活性，导致细胞分裂或分化增加、运动能力增[19]强、细胞间连接消失，从而发挥其生物学作用。目的：本研究应用贴壁培养法，培养骨髓间充质干细胞，应用基因转染技术，将HGF基因转染入人骨髓间充质干细胞，通过G418筛选出转染成功的细胞群后扩增出转染成功的细胞克隆，分别应用激光共聚焦、RT-PCR、WesternBlot对比转染前后细胞中HGF的表达，此后，运用酒精性肝硬化病人血清对转染前后的细胞进行诱导分化，7D及14D后分别检测转染前后的各个细胞组中AFP、ALB表达水平，探讨转染人促肝细胞生长因子（hHGF）对人

4、骨髓间充质干细胞（hBMSCs）向肝样细胞分化的影响。方法：(+)1．克隆hHGF基因，构建携带hHGF基因的真核表达质粒（pcDNA3.1-hHGF），5第三军医大学硕士学位论文(+)首先应用PCR法获得HGFcDNA，再次应用限制性内切酶将HGFcDNA及pcDNA3.1切成粘性末端，T4连接酶连接，构建重组载体。2．贴壁培养法扩增人骨髓间充质干细胞，每日倒置显微镜观察细胞生长状况，隔日换液，获得了一些贴壁培养细胞的体会与经验，扩增后选择生长状态良好的细胞进行基因转染。(+)3．用脂质体将pcDNA3.1-hHGF转染人骨髓间充质干细胞，G418筛

5、选转染后的阳性克隆，分别通过激光共聚焦、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫蛋白印迹(Westernblot）检测hBMSCs中表达hHGF的水平；4．用酒精性肝硬化患者血清诱导hBMSCs，采用Westernblot分别检测各组细胞内甲胎蛋白（AFP）及白蛋白（ALB）的表达变化。结果：1．琼脂糖电泳提示，扩增的目的基因hHGF的cDNA为2200bp，成功将此cDNA与带有粘性末端的质粒定向连接，构建的重组质粒经酶切鉴定及测序鉴定，hHGF基因读码框架完全正确；2．细胞培养传代成功，细胞生长良好，呈梭形及鱼群样生长，获取较多生长状态良好的人骨髓

6、间充质干细胞；3．通过脂质体将重组质粒成功的导入了人骨髓间充质干细胞，经过G418筛选，激光共聚焦、RT-PCR、Westernblot结果均证实经转染hHGF基因后的人骨髓间充质干细胞中hHGF分子呈高表达；4．人骨髓间充质干细胞经过诱导后逐渐变为上皮细胞样细胞，形态呈三角形或不规则形，未经诱导组细胞变化不明显，Westernblot结果表明诱导7D，14D转染hHGF基因后的人骨髓间充质干细胞中AFP、ALB表达明显高于其他实验组。结论：(+)1．扩增了hHGFcDNA全长序列，且成功构建重组质粒pcDNA3.1-hHGF；2．贴壁培养法可培养出人

7、骨髓间充质干细胞，并在体外进行大量扩增，细胞状态良好；(+)3．重组质粒pcDNA3.1-hHGF可通过脂质体转染，hHGF基因在转染的细胞内可以成功表达目的蛋白；4．人骨髓间充质干细胞经酒精性肝硬化血清诱导后可向肝样细胞分化，hHGF基因转染后的细胞向肝样细胞分化的能力增高，表明hHGF基因在细胞内成功表达后可以提高人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的能力。6第三军医大学硕士学位论文(+)综上，人骨髓间充质干细胞转染pcDNA3.1-hHGF后可显著提高细胞中HGF因子的表达，经诱导后可提高AFP、ALB的表达水平促进向肝样细胞分化，为终末期肝病的治疗

8、提供了新思路及实验依据。关键词：人骨髓间充质干细胞；人促肝细胞生长因子；肝样细胞；甲胎蛋白；白