两型性莱氏野村菌交替氧化酶（aox）基因的克隆及功能研究

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1、两型性莱氏野村菌交替氧化酶（AOX）基因的克隆及功能研究重庆大学硕士学位论文（学术学位）学生姓名：周桂林指导教师：王中康教授专业：生物学学科门类：理学重庆大学生命科学学院二O一五年四月ThegenecloningandfunctionalanalysisofanAlternativeOxidase（AOX）indimorphicfungusNomuraearileyiCQNr01AThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheMaster’sDegreeof

2、ScienceByGuilinZhouSupervisedbyProf.ZhongkangWangSpecialty:BiologySchoolofLifeSciences,ChongqingUniversity,Chongqing,ChinaApril,2015中文摘要摘要虫生真菌因在防治农林害虫时具有对环境无污染、无残留和使害虫不易产生抗药性等优点，是一种环境友好型真菌。随着人们对环保意识的增强，利用虫生真菌防治农林害虫受到人们的广泛关注及重视。莱氏野村菌在田间能够自然侵染多种夜蛾科害虫并引起域内流行病，是一种重要的昆虫病原真菌。莱氏野村菌作为杀虫剂的有效成分是

3、分生孢子，但是由于其产孢条件比较苛刻如需要苛刻的碳源（麦芽糖）和持续光照，其工业化生产方面一直受到极大限制，所以寻找该菌的其他繁殖体来代替分生孢子行使杀虫作用具有十分重要的意义。液体发酵产生的芽生孢子虽然有一定侵染力，但因其细胞壁比较薄、不耐储存以及毒力低等特点也不能用于生产实践。微菌核是真菌菌丝聚集而形成特异休眠体结构，它具有耐储存、抗逆性强、在适宜的环境下能萌发产生菌丝和孢子。重庆大学生命科学学院微生物实验室成功的诱导出莱氏野村菌的微菌核，并对其的抗逆性和毒力等进行了测试，实验结果证实该微菌核可以作为有效的活性成分来代替分生孢子用于害虫的生物防治制剂。其后，采用

4、比较转录组技术从分子层面来探讨微菌核形成机理，发现在微菌核形成与氧胁迫密切相关，并且在微菌核形成的过程中大量的还原性酶或合成还原性物质的基因上调表达。依据此，本课题从比较转录组上调表达的cDNA文库中挑取Nraox基因的EST序列，将其克隆并采用RNA干扰技术来研究该基因在微菌核发育过程中的作用。主要研究结果如下：①莱氏野村菌Nraox基因的克隆与序列分析根据莱氏野村菌转录组库中Nraox基因的EST序列，克隆得到该基因的cDNA全长序列（GenBank登录号：No.KM978957）。序列分析显示其开放阅读框为1068bp，编码355个氨基酸；生物信息学分析表明该

5、蛋白的理论分子量为40.517KD，理论等电点为9.53；该蛋白具有亲水性，无信号肽，亚细胞定位分析该蛋白定位于线粒体内。Nraox的基因组全长为1512bp，该基因含有3外显子，2内含子。利用DNAMAN和MEGA软件进行同源比对和系统进化分析发现，莱氏野村菌的AOX蛋白与绿僵菌的同源性最高，并与麦角菌科的真菌聚为一组，同源性都达到88.17%。②莱氏野村菌Nraox的表达分析收集莱氏野村菌微菌核发育不同时期的样品，采用荧光定量qPCR的方法对Nraox基因的表达模式进行分析，结果表明该基因在微菌核发育的不同时期均有表达，并在微菌核形成初期表达量最高，然后降低；采

6、用qPCR技术检测Nraox在氧胁迫诱导剂处理后的基因表达，研究结果表明，氧化剂H2O2和甲萘醌都能引起I重庆大学硕士学位论文该基因的高度上调表达，H2O2处理后Nraox表达量是对照组的7倍，甲萘醌处理后是对照组的20倍。③抑制剂处理对交替氧化酶功能的验证采用交替氧化酶的特殊抑制剂SHAM处理后，检测细胞内过氧化氢含量变化，结果显示，与对照组相比，抑制剂SHAM处理后前10min中内细胞内H2O2较高，处理15min后没有明显变化；但是，显微观察菌丝形态发现与对照组相比，处理组菌丝表现为弯曲和很多芽状结构的不正常生长状态；而诱导培养基中的微菌核表现为微菌核的形成延

7、迟、微菌核颗粒直径较大以及微菌核结构松散、表面比较蓬松。由此可以确定，抑制剂处理后减缓了细胞内过氧化氢的清除速度，并对细胞产生了一定的氧毒害。④RNA干扰技术验证Nraox基因功能利用RT-qPCR技术对不同浓度siRNA的干扰效率进行检测，结果显示800nMsiRNA能够有效下调Nraox基因的表达，并且该基因表达量下调了约76.1%。与对照组相比，干扰菌株在含有胁迫诱导剂的固体SMAY培养基上生长时，菌落生长缓慢，菌落变小，产孢量降低。而在微菌核诱导培养基AM中生长时，Nraox基因干扰后的微菌核表型发生了明显变化，主要表现为：与野生菌相比，微菌核的形成推迟