脂肪酶在毕赤酵母中的表达及其在餐厨废弃油脂转化中的应用

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1、暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：脂肪酶在毕赤酵母中的表达及其在餐厨废弃油脂转化中的应用AstudyonexpressionoflipaseinPichiapastorisanditsapplicationinconversionofwastecookingoil作者姓名：姜苏峻指导教师姓名及学位、职称：刘泽寰博士研究员学科、专业名称：微生物学学位类型：（学术学位/专业学位）论文提交日期：论文答辩日期：答辩委员会主席：论文评阅人：I独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，

2、除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日暨南大学硕士学位论文摘要利用脂肪酶将餐厨废弃油脂转化为生物柴油能够实现餐厨垃圾的绿色化、资源化利用。本研究构建了能表达脂肪酶的基因重组毕赤酵母，利用重组酵母表达的脂肪酶替代传统化学催化剂，以绿色无毒的乙醇替代甲醇作为酰基受体进行转酯化反应生产生物柴油。本研究从米根霉（Rhiz

3、opusoryzae）CICC3005cDNA文库扩增得到脂肪酶基因（proROL），克隆进毕赤酵母表达载体pGAPZαA，电转入毕赤酵母（Pichiapastoris）X-33中，筛选得到重组脂肪酶活性较高的阳性克隆Pichiapastoris-proROL，并对所表达的重组脂肪酶的酶学特性进行了研究。重组脂肪酶最高酶活为426.6U/mL；最适pH为pH8.0，酶活在pH6.0-8.0范围内稳定；最适温度为30℃，酶活在30-35℃之间稳定。重组脂肪酶酶活被2+2+++金属离子Mn、Zn、Na、K促进，被0.001%的Tri

4、tonX-100和0.01%的SDS促进，对甲醇、甲苯和正己烷具有较高的耐受性。重组脂肪酶对8C和14C碳链长度的底物表现出较强的偏好性。以餐厨废弃油脂为原料，以无水乙醇为酰基受体，以重组脂肪酶为催化剂进行转酯化反应生产生物柴油，研究了水含量、醇油摩尔比和酶添加量对转酯化反应效率的影响，在水含量为5%，醇油摩尔比为4:1，酶添加量为10%的条件下转酯化反应效率最高，此时生物柴油最高得率为49%。本研究构建了能表达脂肪酶的重组毕赤酵母，并以重组脂肪酶替代传统化学催化剂，以乙醇替代甲醇作为酰基受体生产生物柴油，减少了化学试剂的使用，

5、能节约成本，降低对环境的污染，为今后餐厨垃圾的绿色化、资源化利用开辟了一条新途径。关键词：餐厨废弃油脂；生物柴油；米根霉；脂肪酶；毕赤酵母；转酯化反应I暨南大学硕士学位论文AbstractUsinglipasetochangewastecookingoilintobiodieseliseffectiveforthegreenandresourceutilizationoffoodwaste.Inthecurrentwork,arecombinantPichiapastoriswhichcanexpresslipasewascos

6、ntructed.Usingrecombinantlipaseinsteadoftraditionalchemicalsascatalyst,andgreennontoxicethanolinsteadofmethanolasacylreceptor,thewastecookingoilwaschangedintobiodieselthroughthetransesterificationreaction.proROLfromRhizopusoryzaeCICC3005wasclonedintothevectorspGAPZαA

7、andsubsequently,electrotransformedintoPichiapastorisX-33.Arecombinantstrainwiththehighestenzymeactivitieswasisolated.ThecharacteristicsoftherecombinantproROLwascarriedout.Theresultsshowedthatthehighestlipaseactivitywas426.6U/mLwhenusingoliveoilassubstrate.Theoptimump

8、HfortherecombinantproROLwaspH8.0andthelipasewasstablefrompH6.0to8.0.TheoptimumtemperaturefortherecombinantproROLwas30℃,andthelipase