牛流行热两种elisa诊断技术的建立与应用

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1、－．韦二．，０７５８１分类号如巧．３学校代码：：１２３６０２０３０７：密级：公开学号Ｊｆ＃《寺乂乐硕去学位论文＜，牛流巧热两种ＥＬＩＳＡ诊断技术的建立与应用％ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＴｗｏ枯ｎｄｓｏｆＥＬＩＳＡｆｏｒＢｏｖｉｎｅＥｈｅｍｅｒａｌＦｅｖｅｒｐ、１’ｆ？、研究生姓名＾导师姓ｉ及职称獻宏研究员合作师姓名及职称岳城教授导学位壬■口类穀别农学硕专业名称预防兽医学研究方向动物病毒及分于生物学所在学院动物度学学院＞

2、？：疆乌鲁木齐：新‘－—二〇五年六月‘．－Ｖ／－＇－－．，！Ｉ．？Ｓ独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得，论文中的研究成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外不包含其他人已经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得新疆农业大一学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献巧已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名、时间：年／月曰：違矣Ｉ关于学位论文使用授权的说明疆农业本人大学完全有权了保解新疆农业大

3、学有关保留、使用学位论文的规定，目Ｐ：新留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子文文档被，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论入有关查数阅据和库借进阅行。检本索人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编论文，可ｙ？公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密的学位在解密后应遵守此协议）研究生签名：違為ｎ时间：年／月曰咬导师签名：时间：ＪｄＡＴ年月巧曰Ｌ牛流行热两种ELISA诊断技术的建立与应用摘要牛流行热(bovineephemeralfever，BEF)是由牛流行热病毒(bovineephemeralfevervi

4、rus)引起的一种牛的非接触性的虫媒病毒性疾病，该病引起牛的高热、流产，役用牛跛行和瘫痪，奶牛的产奶量下降，对养殖业造成重大损失。BEFV编码有5种结构蛋白和其他未知功能的蛋白，其中G蛋白是主要的免疫原性蛋白，其表面存在4个抗原位点，G1为BEFV所特有，且G1抗原位点在BEFV中很保守。目前，国内外均没有商品化的诊断BEFV或其抗体的试剂盒。另外，在国内外检测牛流行热病毒或其抗体的方法，有RT-PCR、LAMP、实时荧光定量PCR、微量中和试验等方法，但是这些方法几乎没有用于临床样品的筛查，这些检测方法需要昂贵的实验设备、试剂、耗材以及专业的技术人员，不适于野外样品的调查，无法广

5、泛的应用于基层和大规模的流行病学调查。本研究对包含部分抗原表位的BEFVG1基因片段进行克隆表达、纯化，进行反应原性和特异性分析，最后以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了检测BEFV抗体间接ELISA诊断方法，并且成功开发了试剂盒，对中国部分地区2822份血清进行流行病学调查。同时，本研究也针对BEFV的免疫保护基因G基因的G1抗原表位，合成单克隆抗体，作为包被抗体(捕获抗体)，以抗BEFV的高免血清(多克隆抗体)作为追踪抗体，建立了检测牛流行热病毒抗原的抗原捕获ELISA方法，并且对200份野外的全血样品对其进行了评价。研究结果如下：1.以本实验室保存的BEFV(LYC11株)的G

6、基因质粒为模板，根据GenBank上登录的BEFV(LYC11株)全病毒基因组序列设计特异性引物，通过PCR扩增得到包含G1基因的DNA片段，经测序验证后，用原核表达系统进行表达，经过反应原性和特异性分析，证明该重组蛋白具有很好的反应原性，只与抗BEFV的抗体进行反应。2.以纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立了检测BEFV抗体的间接ELISA方法，并且对该方法进行优化，开发了BEFV抗体检测间接ELISA试剂盒，使其可以稳定的应用于临床样品的检测。3.以开发的试剂盒对我国26个省份的2822份血清进行了检测，BEFV抗体的阳性率为0%－81%，并且对血清学调查结果进行了详细的讨论。4

7、.针对根据GenBank登录的BEFV(LYC11株)G1基因序列合成了抗-G1抗原位点的单克隆抗I体，并且对其反应性和特异性进行评估，结果证明，该单克隆抗体具有良好的反应性和特异性，并对其效价进行评估。5.以合成的单克隆抗体和多克隆抗体分别为捕获抗体和追踪抗体，建立了检测BEFV抗原的抗原捕获ELISA方法，利用200份临床样品对该方法进行进一步评价，成功建立了检测BEFV抗原的AC-ELISA方法。关键词：牛流行热病毒(BEFV)；G1；间接ELISA；试剂盒；血