香樟内生菌代谢产物的生物活性研究

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1、学校代码：10270分类号：Q93学号：152200855硕士学位论文香樟内生菌代谢产物的生物活性研究学院：生命与环境科学学院专业：微生物学研究方向：微生物分子生物学研究生姓名：张莹指导教师：陈军副教授完成日期:2018年3月上海师范大学硕士学位论文摘要摘要香樟木材坚硬美观且散发特殊芳香味，能驱虫防霉，有一定抗氧化能力，是制备家具的首选良材，目前对香樟的抗性研究主要集中在香樟的化学成分而忽略了生活在香樟内部的内生菌，导致其巨大的应用价值未得到充分的开发。内共生理论已经表明，植物内生菌能够产生与宿主植物相同或相似的代谢产物。本文通过组

2、织分离法分离到香樟内生菌，测定香樟内生菌代谢产物清除DPPH、OH自由基能力评价其抗氧化能力，利用滤纸片琼脂扩散法和生长速率法评价其抗菌能力，筛选生物活性良好的香樟内生菌鉴定并分析活性机理，通过响应面分析法对香樟内生菌产生的活性物质进行优化并采用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析等方法对活性物质分离纯化，旨在研究香樟内生菌的生物活性与香樟抗性机理的作用关系，为香樟及内生菌在生物防腐处理，病虫害防治、医疗保健等方面的应用提供理论依据。论文研究的结果如下：1、利用组织分离法从香樟根部和茎部筛选到15株内生真菌，活性测试发现部分内生菌代谢产物有良好

3、的生物活性。在抗氧化测试中乙酸乙酯提取的EndophyteR5，EndophyteS6代谢产物清除DPPH自由基能力较强，乙酸乙酯提取的EndophyteR5和EndophyteS2代谢产物清除OH自由基能力较强；在抗菌测试中甲醇提取的EndophyteR5代谢产物对金黄色葡萄球菌的MIC为20mg/mL，对枯草芽孢杆菌的MIC值为40mg/mL，甲醇提取的EndophyteR5和乙酸乙酯提取EndophyteS5代谢产物对青霉有较明显的抑制作用，乙酸乙酯提取的EndophyteR7和EndophyteR8代谢产物对黑曲霉的抑菌效果

4、较好。2、通过形态学观察和分子生物学鉴定发现与EndophyteR5相似度最高的是木霉属中的绿色木霉。经文献查阅，推测其抗性机理与代谢产物β-葡萄糖苷酶有关，此酶可促进香樟内含萜烯基和芳香族配基为主的芳樟醇前体化合物生成挥发性芳樟醇，芳樟醇具有良好的防虫抗菌功效，另外绿色木霉还可产生木霉素、胶霉素等抗生素类产物抑制病原菌的生长。绿色木霉代谢产物表现出一定的抗氧化能力可能与产生多酚类物质衍生物有关。3、以察氏培养基为基础培养基进行优化确定最佳培养基组分为乳糖39.47g，NaNO33.96g，MgSO4·7H2O0.53g，K2HPO

5、41g，KCI0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，预测酶活力1.873U/mL，实际测得酶活力1.825U/mL，在此基础上对发酵条件进行优化，最佳发酵条件为装液量50.83mL，接种量5%，pH5.06、转速140r/min、温度30℃，此条件下酶活力2.36U/mL，验证实验测得2.24U/mL，比未优化之前提高40.88%。I摘要上海师范大学硕士学位论文4、采用70%硫酸铵对绿色木霉发酵培养基浸提的粗酶液进行沉淀时，酶比活力达1.27U/mg，比粗酶液提高2.19倍，采用SephadexG-100凝胶过滤层析对酶液进一步

6、纯化得到3个蛋白质吸收峰，第2个吸收峰酶比活力为5.74U/mg，酶纯度提高了9.89倍。纯化后的样品经SDS-PAGE电泳后仅出现一条带，说明纯化效果较好，分子量为68KDa。关键词：香樟内生菌；代谢产物；生物活性；响应面分析；β-葡萄糖苷酶IIShanghaiNormalUniversityMasterofPhilosophyAbstractAbstractCamphorwood,withhardtexture,artisticgrainsandspecialfragrance,isapreferredtimberformaki

7、ngfurniture,whichcanrepelinsectsandpreventmildew,withcertainantioxidantcapacity.Currentstudiesonresistanceofcamphoraremainlycenteredinitschemicalcompositionwhileneglectingtheendophytelivinginsideit,whichhasresultedininsufficientdevelopmentofitsimmenseapplicationvalue.E

8、ndosymbiontictheoryhasindicatedthatendophytelivingintheplantscanproducemetabolitesidenticalorsimilartothehostplant.Th