运用crisprcas9基因编辑技术敲除tshr基因构建ch大鼠模型的研究

《运用crisprcas9基因编辑技术敲除tshr基因构建ch大鼠模型的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号：密级：UDC：学号：416523512246南昌大学运用CRISPR/cas9基因编辑技术敲除Tshr基因构建CH大鼠模型的研究StudyonthetransgenicratmodelofcongenitalhypothyroidismviaCRISPR/cas9杨建强培养单位（院、系）：南昌大学第一附属医院指导教师姓名、职称：周文胜副教授申请学位的学科门类：医学学科专业名称：耳鼻咽喉头颈外科学论文答辩日期：2015年6月答辩委员会主席：刘月辉评阅人：刘红兵汪国武2015年6月2日一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人

2、在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）：杨建强签字日期：2015年6月2日二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部

3、或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写）：杨建强导师签名（手写）：周文胜签字日期：2015年6月2日签字日期：2015年6月2日论文题目运用CRISPR/cas9基因编辑技术敲除Tshr基因构建CH大鼠模型的研究姓名杨建强学号4165235122

4、46论文级别博士□硕士√院/系/所南昌大学医学部专业耳鼻咽喉科学E_mail备注：□公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，年月后公开）I摘要摘要先天性甲状腺功能减症（CongenitalHypothyroidismCH）是一种新生儿常见的内分泌代谢性疾病，临床表现为患儿体格发育迟滞和智能发育严重障碍。正是因为其高发病率且可导致机体多个器官的发育迟滞，所以我们有必要进一步深入研究CH影响器官正常发育的作用机制。由于伦理学问题，人类不可能在对CH患者做出诊断后不进行治疗而继续进行研究，所以在体研究只能依靠CH动物疾病模型。但因为目前世界上

5、缺乏基因敲除的CH大鼠模型，所以研究者获取CH大鼠模型都是通过药物诱导的，而这显然无法真正模拟由于基因突变所造成的CH对大鼠机体发育的影响，所以通过敲除调控甲状腺发育或者甲状腺激素合成的相关基因以构建CH大鼠模型成为了CH深入研究的必要前提。本项研究在世界上首次运用CRISPR/cas9基因编辑技术通过敲除促甲状腺激素受体（Tshr）基因成功构建了CH大鼠疾病模型，为今后最终明确甲状腺激素在器官发育过程中的作用机制以及CH的病理机制提供了研究基础。研究主要内容：一、目的质粒的构建和RNA体外转录：将pX330-U6-Chimeric_BB-

6、CBh-hSpCas9质粒（addgenePlasmid#42230）进行目的基因的克隆，即通过酶切、连接和转化扩大培养等步骤获取目的质粒。目的质粒构建成功后转染大鼠BRL细胞进行敲除效率验证。选取效率高的目的质粒进行体外转录，分别获得cas9RNA和sgRNA。二、受精卵显微注射及移植对清洁级SD野生型雌鼠促排卵获取受精卵，运用显微注射平台对受精卵注射cas9RNA和sgRNA混合物，再选取注射成功的优质受精卵移植回清洁级SD假孕雌鼠输卵管内，移植完成后待正常分娩。三、F0代幼鼠基因型的鉴定及脱靶情况的分析在F0代幼鼠出生后第21天取幼鼠

7、鼠尾提取基因组DNA，进行基因测序分析。测序结果出现套峰后，对PCR产物进行载体亚克隆，分析基因敲除结果，选取5个可能存在的脱靶位点进行基因测序分析。四、F0代大鼠表型的观察及相关激素的检测I摘要对基因敲除幼鼠继续进行常规饲养，对体重等表型进行长期观察记录，在出生第13周使用酶联免疫吸附测定法（Elisa法）对实验组及对照组的T3，T4，TSH等激素进行检测。研究成果和结论：运用CRISPR/cas9基因编辑技术成功敲除大鼠受精卵的Tshr基因，在世界上首次成功获得了Tshr基因敲除的CH大疾病模型。关键词：CRISPR/cas9；先天性甲

8、状腺功能减低症；疾病模型；基因敲除；促甲状腺激素受体IIAbstractABSTRACTCongenitalhypothyroidism(CH)isacommonendocrin