利用crisprcas9敲除绵羊成纤维细胞mstn基因的研究

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1、分类号：密级：学号：2011108046单位代码：10759石河子大学硕士学位论文利用CRISPR/Cas9敲除绵羊成纤维细胞MSTN基因的研究学位申请人李炜杰指导教师何高明皮文辉周平申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称临床兽医学研究方向动物临床疾病所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年5月ResearchofCRISPR/Cas9knockoutMSTNgeneinOvisariesfibroblastsADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmento

2、ftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByLiWei-jie(ClinicalVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.HeGao-mingDr.PiWen-huiDr.ZhouPingJune,2015本研究受国家转基因重大专项---《优质转基因肉羊新品种培育》(NO:2014ZX08008-003)资助。ThisresearchissurpportedbytheNationalTransgenicMajorProgramnam

3、edbyThehighqualityoftransgenicmuttonsheep.(NO:2014ZX08008-003)摘要目的：肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)，又称生长/分化因子8(GDF8)，是TGF-β超家族成员之一，该基因对骨骼肌的生长发育具有负调控作用。该基因功能的缺失，能够引起肉用动物的“双肌”表型，从而提高动物的产肉率。Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9系统和类转录激活因子效

4、应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)是两种最新人工设计核酸酶，可用于各种复杂的基因组编辑。本研究通过设计CRISPR/Cas9和TALEN两种人工核酸酶分别作用于绵羊MSTN基因第一外显子和第三外显子，通过电转染的方式将CRISPR/Cas9和TALEN质粒转入绵羊成纤维细胞，以期获得MSTN基因发生突变的绵羊成纤维细胞，为获得MSTN基因突变的转基因肉羊研究工作奠定基础。方法：试验一采用GoldenGate等构建方法，对构建好的质粒进行感受态转化和去内毒素质粒提取

5、，利用琼脂糖电泳检测是否成功构建Cas9和TALEN质粒。试验二采用Lonza4D-Nucleofector电转染设备和试验室配制的电转液L，将pMAX绿色荧光蛋白表达质粒导入绵羊成纤维细胞。通过对电转染程序、细胞数量、质粒浓度、不同电击次数以及电转后不同的放置温度等几个条件进行优化，经流式细胞仪测定和荧光显微镜观测细胞的转染效率，以期得到L电转液最佳电转方案。试验三通过电转染的方法将CRISPR/cas9和TALENs质粒电转到绵羊成纤维细胞，采用Surveyornuclease、T7E1（T7Endonuclease1）和HRM(Hig

6、hResolutionMelt)三种检测方法，检测作用于绵羊MNST基因第一外显子CRISPR/Cas9和第三外显子TALEN的生物学活性，确定目标靶点DNA是否发生突变。试验四将鉴定的具有CRISPR/Cas9和TALEN生物活性的细胞，进行有限稀释后，在体视显微镜下使用毛细管吸取单个细胞接种到96孔板中，每个孔中接种一个单细胞，经传代培养得到不同的单细胞系，将传代培养的单细胞通过HRM技术，PAGE检测和直接测序三种方法鉴定突变的单克隆细胞。结果：试验一结果显示经琼脂糖电泳检测到CRISPR/Cas9和TALEN质粒，其片段大小分别CR

7、ISPR/Cas9质粒9999bp，sgRNA质粒4930bp，TALENL/R质粒8322bp，成功构建CRISPR/Cas9和TALEN质粒。试验二结果显示L电转液最佳电转染方案：100µl的L电转液悬浮2×106个细胞，选择CZ-167电转程序，质粒总量为4µg，电击一次后37℃放置10min，可获得理想的电转染效率。试验三检测结果显示作用于绵羊MNST基因第一外显子CRISPR/Cas9和第三外显子TALENs的目标靶点均发生了突变。试验四结果显示将传代培养的单细胞通过HRM技术，PAGE检测和直接测序三种方法鉴定，成功筛选到单克隆

8、突变细胞。结论：1、成功构建作用于绵羊MSTN基因第一外显子的CRISPR/Cas9质粒和第三外显子的TALEN质粒。2、采用电转染的方式将两种质粒转入绵羊成纤维细胞中，通过HR