苹果褪绿叶斑病毒与苏俄苹果互作寄主因子的鉴定及亚细胞定位

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1、hi^I•AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI全日制硕士专业学位（毕业）论文苹果褪绿叶斑病毒与苏俄苹果互作寄主因子的鉴定及亚细胞定位学位申请人：何乙坤指导教师：王亚南副教授曹克强教授学位名称：农业推广硕士研究领域：植物保护授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月三日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成災。拟我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发农或撰、过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其

2、他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我•同工作的同志对本研究所做的仟何贡献均已在论文屮fl了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：1可&七卞签字Fl期：年&月§*M学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被査阅和借阅。本人授权河^匕农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的，位论文在解密后适用本授权书）

3、学位论文作者签名:彳导师签名：签字円期：X年签字丨丨期：年11学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话:通讯地址：邮编:分类号：S432.1单位代码：10086密级：公开学号：20139130655苹果褪绿叶斑病毒与苏俄苹果互作寄主因子的鉴定及亚细胞定位IdentificationandSubcellularLocalizationofHostFactorsfromMalussylvestriscv.R12740-7AInteractingwithACLSV学位申请人：何乙坤指导教师：王亚南副教授

4、曹克强教授学位名称：农业推广硕士研究领域：植物保护授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月三日摘要苹果褪绿叶斑病毒（Applechloroticleafspotvirus，ACLSV）是苹果上危害最大的一类潜隐性病毒，广泛分布于世界各地。该病毒单独侵染或与其它病毒混合侵染严重影响果树产量及果实品质，造成严重的经济损失。本研究在利用酵母双杂交技术筛选能与ACLSVCP、MP互作的苏俄苹果寄主因子的基础上，通过生物信息学分析，从中选取可能具有重要功能的寄主因子。利用酵母双杂交、Pull-dow

5、n技术进行进一步互作验证。然后，对ACLSV功能基因CP、MP及互作寄主基因Malus15-1进行了亚细胞定位。本研究结果将为揭示寄主基因在ACLSV侵染过程中具有的生物学功能及两蛋白互作的意义奠定基础。主要研究结果如下：1.利用酵母双杂交技术验证了苏俄苹果寄主因子Malus15-1、Malus40-5与ACLSVCP、MP的互作。首先，构建带有完整寄主基因Malus4-1、Malus15-1、Malus40-5、Malus72-3、Malus85-1、Malus86-1的酵母双杂交表达载体。然

6、后，利用共转化法将诱饵载体pGBKT7-CP、pGBKT7-MP与带有上述6种寄主基因的酵母表达载体转化至酵母菌株Y2Hgold中，将共转化产物涂布于四缺（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal）培养基上，观察酵母的生长及显色情况，验证寄主功能基因与寄主基因之间的互作。结果表明寄主因子Malus15-1、Malus40-5在四缺平板上菌落呈明显蓝色，证明CP、MP与寄主因子Malus15-1、Malus40-5互作。2.利用Pull-down技术验证了ACLSVCP、MP与

7、寄主因子Malus15-1之间的相互作用。首先，构建原核表达载体pET28a-CP、pET28a-MP、pET28a-15-1和pET28a-40-5，然后将重组载体转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，并诱导表达目的蛋白。采用Pull-down方法，将洗脱产物经SDS-PAGE、Westernblot检测蛋白间的互作。结果表明，以CP为诱饵捕获Malus15-1蛋白，洗脱产物中有21.5kDa、16kDa两条明显条带；以MP蛋白为诱饵捕获Malus15-1蛋白，洗脱产物中有50.8k

8、Da、16kDa两条条带，证明CP、MP与Malus15-1之间存在直接相互作用。同样分别以CP、MP为诱饵捕获Malus40-5蛋白，洗脱产物中仅有一条条带，证明CP、MP与Malus40-5蛋白之间无相互作用。3.揭示了ACLSVMP、CP及Malus15-1在本氏烟细胞中的定位情况。构建瞬时表达载体pCam35s-gfp-CP、pCam35s-gfp-MP及pCam35s-gfp-15，利用液氮冻融法将重组载体转入农杆菌EHA105菌株，在供试本氏烟叶片下表皮注射农杆菌，利用激光共聚焦显微