苹果褪绿叶斑病毒的分子杂交检测.pdf

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1、安徽农业科学，JournalofAnhuiAgri．Sci．2013，41(31)：12324—12325责任编辑陈红红责任校对卢瑶苹果褪绿叶斑病毒的分子杂交检测杨洪一，李昱莹(东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨l50o40)摘要[目的]探索检测苹果褪绿叶斑病毒的技术体系。[方法]利用CTAB法提取感病苹果叶片总RNA，以总RNA为模板，利用特异性引物，建立利用cDNA探针检测苹果褪绿叶斑病毒的技术体系。[结果]扩增出了预期片段，经克隆、测序证明该片段为苹果褪绿叶斑病毒的特异性片段。以带有特异片段的质

2、粒为模板，利用PCR技术制备出地高辛标记的cDNA探针。[结论]以质粒为模板可高效制备大量探针。地高辛标记探针为非放射性标记探针，安全性较好，灵敏度较高，具有重要的应用价值。关键词苹果褪绿叶斑病毒；cDNA探针；检测中图分类号$436．611．19文献标识码A文章编号o5l7—66l1(2013)31—12324—02DetectionofApplechoroticleafspotvirusbyDot—blotHybridizationYANGHong-yietal(CollegeofLifeScienc

3、e，No~heastForestryUniversity，Haerbin，Heilongjiang150040)Abstractl0bieetiveITheaimwastodevelopasystemofdetectionforApplechoreticleafspotvirus(ACISV)withmolecularhybridiza-tion．IMethod1TotalRNAwasextractedfromtheleavesofinfectedapplebyCTABmethod。andthetotal

4、RNAwasusedasthetemplatetoamplifythegenomeofACLSVwiththeACLSVspecificprimers．ThesystemofdetectionofACLSVwasdevelopedbycDNAprobe．1ResuitlThepredictedfragmentwasobtained．andthespecificfragmentwasverifiedbycloningandsequencing．，I1Iedigoxigenin·labeledeDNAprob

5、eispreparedbyPCRusingtheplasmidwiththespecificfragmentasatemplate．[Conclusion]eplasmidDNAWasusedasthetemplate，thenanumberofprobecouldbeefectivelyprepared．Inaddition，tIledigoxigenin．1abeledprobewasanon．radioactiveone。SOitwassafeandwasalsohighsensitive．Thep

6、robehasanimportantsignificanceforapplication．KeywordsAppleehoroticleafspotvirus：cDNAprobe；Blothybridization：Detection·苹果是最广泛种植的温带果树之一，目前其世界总产量1．2方法已近7000万t⋯。苹果褪绿叶斑病毒(Applechoroticleafspot1．2．1CTAB法提取总RNA。取少量新鲜苹果叶片(约virus，ACLSV)是一种严重危害果树生产的潜隐病毒，可侵染0．05g)放入

7、已灭菌的研钵中，加入液氮快速研磨，研至细腻多种果树，如苹果、梨、桃、木瓜、李子、樱桃、杏，以及多种蔷的粉末状时用钥匙转移至1．5ml离心管中，再向离心管中加薇科观赏树种，常与苹果茎沟病毒复合侵染，影响果树长入490CTAB缓冲液和lOB-巯基乙醇，混匀，65℃恒温势及产量。目前已获得苹果褪绿叶斑病毒的基因组全序水浴15min，期间上下颠倒离心管使其混合均匀。加入与上列。其基因组核酸为线性正义单链RNA，大小7555nt，述混合液等体积的氯仿、异戊醇(24：1)混匀，12000r／min，离基因组含有3个互

8、相重叠的ORF(开放阅读框)，分别编码心4min。弃沉淀，抽取上清液转移至1．5ml离心管中，再次216．5、50．4和21．4kDa蛋白，最大的ORF编码产物可能参加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇(24：1)，混匀后12000与病毒复制，最小的蛋白为外壳蛋白。基因组5端有帽子结r／min离心4min。弃沉淀，抽取上清，再加入2倍体积的无构，3端有poly(A)尾。建立病毒快速检测技术是控制水乙醇至1．5lIll离心管中，混匀