胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响

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SOOCHOWUNIVERSITY论文题目胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响研究生姓名李旭忠指导教师姓名____________张学利专业名称外科学（普通外科）研究方向胃转流手术与2型糖尿病论文提交日期2015年5月 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文□本学位论文属在年月解密后适用本规定。非涉密论文 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响中文摘要胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达胃胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响的的影响影响摘要目的：通过建立肥胖性2型糖尿病（T2DM）胃转流手术（GBP）大鼠模型，探讨GBP手术对肝脏糖代谢相关因子表达的影响。方法：将12只6周龄SD大鼠随机分为正常对照组（NCD，n＝4）、高脂组（HFD，n＝4）和高脂手术组（HFD-GBP，n＝4）。HFD组大鼠经高脂饲料喂养4周后，通过腹腔注射链脲佐菌素构建T2DM模型，术前比较两组体质量、空腹血糖（FPG）、葡萄糖耐受、胰岛素敏感性的变化。2周后，构建HFD-GBP组胃转流手术模型，连续观察2周，比较手术前后两组体质量、空腹血糖、血清胆汁酸（BA）、总胆固醇（TCH）、甘油三酯(TG)的变化，并分别提取3组大鼠肝组织的总RNA和蛋白，通过RT-PCR、Western印迹法检测法呢醇X受体（FXR）、磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶（PEPCK）、葡萄糖−6−磷酸酶（G6Pase）、葡萄糖转运体2（GLUT2）和成纤维细胞生长因子-21（FGF-21）的表达水平。结果：与NCD和HFD组大鼠相比，HFD-GBP大鼠血清总胆汁酸水平显著升高（p<0.05;p<0.01）；与NCD组相比较，HFD组的血清总胆固醇和甘油三酯水平明显升高（p<0.05;p<0.05）；与HFD组相比，HFD-GBP组大鼠体重下降，血糖含量降低（p<0.05），血清总胆固醇和甘油三酯水平显著降低（p<0.05;p<0.01），术后肝脏FXR和GLUT2mRNA表达明显上调（p<0.05），PEPCK、G6Pase和FGF-21mRNA水平表达也增加；与NCD组相比，HFD和HFD-GBP两组FXR和PEPCK蛋白表达明显升高（p<0.05）。结论：在肥胖型T2DM大鼠模型中，GBP手术能有效改善糖代谢；GBP术后的血清胆汁酸水平明显升高；FXR、PEPCK、GLUT2和FGF-21的表达变化可能参与GBP术后的血糖调节过程。I 中文摘要胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响关键词:胃转流术；2型糖尿病；胆汁酸；法呢醇X受体；磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶作者：李旭忠指导老师：张学利教授II 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响英文摘要TheTTheheeffecteeffectffectofooffGastricGGastricastricBypassBBypassypassonoonnexpressioneexpressionxpressionofooffglycometabolism-relatedgglycometabolism-relatedlycometabolism-relatedfactorsffactorsactorsiniinnthettheheliverlliveriverofooffT2DMTT2DM2DMratrratatAbstractAAbstractbstractObjectiveWeestablishedtype2diabetes-GastricBypassratmodel,toexploretheeffectofGBPonexpressionofglycometabolism-relatedfactorsintheliver.MethodsTwelveonlysixweeksoldRatswererandomlydividedinto3groupsofnormalchowdiet(NCD),high-fatdiet(HFD)andhigh-fatdietfollowedbyGBP(HFD-GBP).4weeksafterhigh-fatdiet,ratswereinjectedwithSTZintraperitoneallytoinducetype2diabetes.Then,wemonitoredbodyweightandfastingbloodglucoseconcentrationweekly,andexaminedperoperativeglucosetoleranceandinsulinsensitivityinHFDrats.2weekslater,weperformedtheGBPoperationonHFDrats(HFD-GBPgroup).Duringthenext2weeks,weexaminedandcomparedweight,fastingbloodglucose,serumbileacid,totalcholesterolthegroupsandtriglyceridelevelsinthe3groups.TotalRNAandproteinwereextractedfromtheliverofthreegroups,andexpressionofFXR,PEPCK,G6Pase,GLUT-2andFGF-21wasdetectedbyReal-time-PCRandWesternblotting.ResultsComparedwithNCDandHFDgroupofrats,totalserumbileacidleveloftheHFD-GBPratssignificantlyraised(p<0.05,p<0.01).TotalserumcholesterolandtriglyceridelevelsofHFDgroupwereobviouslyhigherthantheNCDgroup(p<0.05;p<0.05)andcomparedwiththeHFDgroup,totalserumcholesterolandtriglyceridelevelsofHFD-GBPgroupweresignificantlylower(p<0.05;p<0.05).ComparedwiththeHFDgroup,weightofHFD-GBPgroupratswasdecreasedandbloodglucoseIII 英文摘要胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响concentrationwasimproved(p<0.05).InliversofHFD-GBPrats,FXRandGLUT2mRNAexpressionsignificantlyraised(p<0.05).Meanwhile,PEPCK,G6PaseandFGF-21mRNAexpressionalsoincreases.ComparedwiththeNCDgroup,FXRandPEPCKproteinexpressionsignificantlyelevated(p<0.05)inHFDandHFD-GBPgrouprats.ConclusionGBPmodelcaneffectivelyimproveglucosemetabolisminobeseT2DMrats.Totalserumbileacidlevelofpostoperativeratssignificantlyraised.FXR,PEPCK,GLUT2andFGF-21mayparticipateinbloodglucoseregulation.KeywordsGastricBypass;Type2diabetesmellitus;Bileacid;FarnesoidXreceptor;PhosphoenolpyruvatecarboxykinaseWrittenbyLIXu-ZhongSupervisedbyZHANGXue-LiIV 目录序言………………………………………………………………………1材料和方法………………………………………………………………71材料与仪器……………………………………………………………71.1实验材料…………………………………………………………71.2实验仪器…………………………………………………………81.3试剂配制…………………………………………………………91.4实验对象…………………………………………………………132方法……………………………………………………………………132.12型糖尿病大鼠模型的建立……………………………………132.2实验动物分组……………………………………………………142.3实验动物的手术方式及术后饲养………………………………142.4建立大鼠胃转流术模型…………………………………………142.5实验观察指标及检测方法………………………………………173统计学处理方法………………………………………………………23实验结果…………………………………………………………………241构建2型糖尿病大鼠模型……………………………………………242手术前后大鼠体重和血糖的变化……………………………………243各组大鼠血清总胆汁酸、胆固醇、甘油三酯水平…………………254引物特异性验证………………………………………………………265各组大鼠肝脏组织中FXR的表达变化………………………………27 6各组大鼠肝脏组织中PEPCK的表达变化……………………………287各组大鼠肝脏组织中G6Pase、GLUT2及FGF-21mRNA的表达变化…………………………………………………………………………29讨论………………………………………………………………………31结论………………………………………………………………………38参考文献…………………………………………………………………39攻读硕士期间发表论文情况……………………………………………48致谢……………………………………………………………………49英汉缩略语名词对照……………………………………………………51 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响序言序言2型糖尿病是一种因葡萄糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱并最终导致胰岛素抵抗及胰岛素相对分泌不足的内分泌代谢疾病。目前全球糖尿病患者数量居高不下，根据国际糖尿病联盟协会统计显示2013年全球糖尿病患者有3.82亿，预计2035[1]年将接近6亿，而在中国现有糖尿病患者已超越1亿，预测到2035将突破1.4亿，而2010年一年全球糖尿病患者的花费高达3760亿美元，预计2030将超过4900亿美元。2010年11月14日即联合国糖尿病日，中华医学会糖尿病分会和国际糖尿病联合会联合发布的“中国糖尿病社会经济影响研究”报告称,中国内地年糖尿病治疗费用占全国医疗总开支的13%，已达1734亿元人民币(约合250亿美元)，未来10-20年这一数字还将快速攀升。糖尿病是人类21世纪最大的公共健康威胁之一，它也是许多微血管病（视网膜病、肾病、神经病变）和大血管病变（早产、心脑血管病、周围血管病变）的风险因子。肿瘤、心血管疾病、糖尿病等非传染性疾病（noncommunicablediseases，NCD）是当前世界上最主要的死亡原因（中国2型糖尿病防治指南(2013年版)）。2011年，国际糖尿病联盟（IDF）公布的数据显示，全球20岁-79岁年龄段成人中，因糖尿病死亡的人数将近460万，占该年龄段总死亡人数的8.2%，这一数值已逼近一些传染病的死亡率，相当于每7秒有1人因糖尿病死亡。约48%的死亡人群年龄在60岁以下。其中，女性中糖尿病死亡人数多于男性。该报告显示，除了非洲(6.1%)，20~79岁年龄组中10%以上的死亡病例归因于糖尿病，其中西太平洋地区的比例最高，占15.3%。中国、印度、俄罗斯和美国的糖尿病死亡人数位列全球前四位，分别有113.2万例、98.3万例、21.7万例和18万例，中国的糖尿病死亡人数约占全球的1/4。与2010年数据相比，2011年全球糖尿病死亡人数增长15.9%。这主要与西太平洋地区的糖尿病患病率升高有关，该地区的糖尿病死亡人数增长了59%，其中大部分与中国迅速增加的糖尿[2]病患者有关。面对糖尿病严重的流行趋势及经济负担，糖尿病的预防和诊治已成为全球的热点问题。糖尿病的传统治疗模式主要采用内科疗法，主要包括饮食控制、体育锻炼、1 序言胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响口服降糖药物及注射胰岛素、糖尿病教育。口服降糖药物分别有:一、胰岛素分泌促进剂：1.磺酰脲类（第一代磺酰脲类：甲苯磺丁脲、氯磺丙脲等，第二代格列本脲、格列吡嗪、格列喹酮等，第三代格列美脲），2.非磺酰脲类（瑞格列奈、那格列奈）3.肠促胰岛素（胰高血糖样肽(GLP－1)类似物：艾塞那肽、利拉鲁肽和依西那肽、二肽酰肽酶－Ⅳ(DPP－Ⅳ)抑制剂：西他列汀和维格列汀、胰高血糖素受体拮抗剂：正处于研究阶段）；二、胰岛素增敏剂：1.噻唑烷二酮类：罗格列酮、吡格列酮、恩格列酮等。2.双胍类：二甲双胍和苯乙双胍。3.脂肪酸代谢干扰剂：依托莫司；三、抑制碳水化合物吸收药物：1.α-葡糖糖苷酶抑制剂（阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖）。2.淀粉不溶素（正处在研究当中）；四、胰岛素：精蛋白生物合成人胰岛素，以及各种基因工程半合成人胰岛素，如门冬胰岛素、甘精胰岛素和地特胰岛素；五、糖尿病相关的其他酶靶调节剂：蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP－1B)抑制剂、果糖1，6－二磷酸酶抑制剂、葡萄糖激酶(GK)激活剂等。此外，诸如胰岛细胞移植治疗及干细胞新兴的疗法，也有不少缺陷。面对糖尿病迅猛的增长趋势，然而并没有一种方法能够较为满意地控制该病及其并发症,且终身服药使得患者长期依从性较差。因此国内外在不断研制新型药物的同时，也在探求治疗糖尿病的新方式。外科手术可治疗2型糖尿病是上世纪60年代被发现，由于其在控制或者延缓2型糖尿病以及并发症的显著疗效逐渐进入临床。许多动物实验和临床实践已经证实了减重手术给糖尿病带来的疗效。目前，较为常见的治疗2型糖尿病的手术方式有胃转流术(GastricBypass,GBP)、空回肠转流术(Jejuno-ilealbypass,JIB)、胆胰转流术(Biliopancreaticdiversion,BPD)、袖状胃切除术(Sleevegastrectomy,SG)、十二指肠转位术(Duodenalswitch,DS)、可调性胃束带术(Adjustablegastricbanding,AGB)等。其中2003至2011调查研究显示(图1)，RYGB临床缓解率较高，应用最多；SG手术过程简单，术后并发症较少，近年来有增加趋势；AGB手术操作简便，但减重及对T2DM的治疗效果相对较差,[3]目前应用较少；BPD手术操作复杂，术后并发症较多而逐渐被弃用。2 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响序言图12003-2011年全球减重手术数量和变化趋势可以说手术治疗是使肥胖症伴或不伴2型糖尿病病人获得长期且稳定疗效的惟一方法,逐渐被医学界所承认并应用于临床。但并不是所有的肥胖患者或糖尿病患者都符合此手术指证，遵循标准必须综合考虑其手术适应症。2011年，由中华医学会糖尿病学分会及外科学分会联合发布的《手术治疗糖尿病专家共识》[4]对手术适应证进行了明确的规定：（1）BMI≥35、有或无并发症的亚裔2型糖尿病病人可考虑行减重或胃肠代谢手术；（2）BMI为30～<35的亚裔2型糖尿病病人中，生活方式和药物治疗难以控制血糖或合并症时，尤其具有心血管风险因素时，减重或胃肠代谢手术应是治疗选择之一；（3）BMI为28～<30的亚裔人群中，如果合并2型糖尿病，并有向心性肥胖（女性腰围>85cm、男性腰围>90cm），且至少额外符合2项代谢综合征标准（高TG、低HDL-ch、高血压），减重或胃肠代谢手术应也可考虑为治疗选择之一；（4）对于BMI≥40或≥35，伴有严重合并症，且年龄≥15岁、骨骼发育成熟，按Tanner发育分级处于4或5级的青少年，在病人知情同意情况下，腹腔镜下可调节胃绑带术（LAGB）或Roux-en-Y转流术（RYGB）也可考虑为治疗选择之一；（5）对于BMI为25～<28的2型糖尿病病人，应在病人知情同意情况下进行手术，严格按研究方案进行，但这些手术的性质应该被视为纯粹只作为伦理委员会事先批准的试验研究的一部分，而不应广泛推广；（6）年龄<60岁或身体一般状况较好，手术风险较低的2型糖尿病病人。而在美国、欧洲等国由于生活、经济等不同，其手术适应症也略有差异。手术是一种有创治疗方式，在欧美等国应用常见。目前在国内也有临床应用，原因在于术后长期控制肥胖和缓解糖尿病的显著疗效。胃转流术后T2DM缓解率高[5-7][8-10]达75%-85%。而且术后血糖改善早于体重下降。减肥手术尽管本身有手术3 序言胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响[7,11]风险，但却能减少肥胖本身相关疾病总的死亡率，并可以减少糖尿病、心脏[12-14]病和肿瘤的发病率。实际上手术效果在早期已经非常明显，有临床实践选取T2DM组和正常葡萄糖耐量组进行对照试验，术后1周，T2DM组血糖显著下降，胰岛素浓度也减少，胰岛素抵抗明显改善，餐后胰高血糖素也分泌增加，C-肽显著下降，依赖葡萄糖的B-细胞功能增加，其中GLP-1增加将近10倍，并且以上结果[10]在术后3个月和1年的依然被维持或进一步加强。最早Pories长期临床研究显示T2DM患者GBP术后血糖能持久保持稳定，78%以上的肥胖性T2DM患者能达到基本控[8]制症状的目的，术后14年病情缓解率仍高达83%。可见，减重手术对糖尿病的[15-16]疗效较之传统疗法，有过之而无不及。Schauer等分析随机对照研究150例伴有T2DM的肥胖患者，接受单独内科治疗、内科治疗+胃转流术及内科治疗+袖状胃切除术后1年和3年的血糖控制情况，发现减肥手术+内科治疗明显优于单独内科治疗。可见，一定时间内减重手术是可以治疗T2DM。临床实践显示年龄越小、病程越短、血糖控制得越好及胰岛细胞功能受损程度越小的患者则术后效果越好。20世纪50年代Drs.Mason和Ito完成了第一个减重手术——空回肠转流术[17]（JIB)。由于术后有关节炎、疼痛、肝功能衰竭等并发症，他们1967年引进胃[18]转流手术方式，几乎没有之前JIB的手术的副作用。尽管如此诸如呕吐、切口感染、吻合口漏、腹腔感染或脓肿、胃肠道出血、肠梗阻、肺栓塞、血栓栓塞早期并发症和吻合口狭窄、吻合口梗阻、切口疝、吸收不良和营养不良等远期并发症也时有出现。总之，约10%-20%接收减重手术的病人有不同程度的以上早期或[19-20]者晚期症状出现。但是，Morino等报告近14000例患者GBP术后60天以内的死[21]亡率为0.25%，出现并发症的患者中有95%是可以治愈的，并不留后遗症。随着腔镜手术的应用，术后并发症也明显减少，加上术后良好的病情监测和护理，术[22]后平均死亡率在0.35%左右。经过半个多世纪的科技发展和临床实践研究，通过手术治疗糖尿病已经取得相当于甚至超越内科治疗的效果。目前胃转流手术已经应用于临床，并在减重和治疗T2DM中取得很大效果，部分患者甚至完全摆脱了糖尿病的困扰，这给无数2型糖尿病患者带来了康复的希望。但是外科有创操作性和术后或多或少的并发症，尤其针对非肥胖的糖尿病患者是否适用，也给我们外科医师以及医学界提出疑问，面对手术治疗2型糖尿病的显著疗效，我们将来会把它当作常规治疗24 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响序言型糖尿病的方式吗？可见，寻找一种从根本上治愈2型糖尿病但又不给患者本身带来后顾之忧的治疗方式才是医学工作者追求的目标。但是，手术治疗糖尿病的潜在作用机制尚未明确。目前研究表明，胃转流术治疗2型糖尿病的作用机制主要有以下方面：①胃肠解剖结构改变；②摄食减少和体重下降；③肠道内分泌激素改变；④肠道菌群的改变；⑤胰腺B细胞功能改变；⑥肝脏和外源性胰岛素敏感性变化；⑦脂肪因子的作用；⑧胆汁酸代谢改变；⑨炎症因子的作用。其中手术前后胆汁酸的变化对糖脂代谢的调控作用是术后作用机制探索的热点。近年来，对胃转流手术后胆汁酸变化对糖脂代谢影响的研究颇多。早在1977[23]年，BennionLJ等就曾报道T2DM患者胆汁酸代谢异常，主要表现为粪便中的胆汁酸含量升高，总胆汁酸池水平上升。经过胰岛素治疗后上述变化减弱。Haeusler[24]RA等研究也指出T2DM患者胆汁酸水平增加，并且胆汁酸成分也发生了变化。[25]然而，至今对胆汁酸在T2DM中的变化尚未得出定论。VincentRP等研究也显示餐后T2DM患者中胆汁酸代谢增强。随着外科手术治疗T2DM进入临床，许多研究[26-28]也发现实施胃转流手术的T2DM患者，术后在体重下降和血糖改善的同时，胆汁酸水平显著增加，并且胆汁酸成分也发生变化。可见，胆汁酸在GBP术后糖代谢调节中发挥非常重要作用。而法尼醇X受体(farnesoidXreceptor，FXR)的出现，使研究更加深入。胆汁酸是FXR的内源性配体，FXR可感受胞内胆汁酸水平，控制胆汁酸的合成与转运。胆汁酸通过FXR对自身的合成进行负反馈调节。［29-30］此外，研究表明FXR激活或者过表达后可以抑制肝脏糖异生，同时增加胰岛[31]素敏感性促进糖原合成，进而改善T2DM。近期RyanKK等在动物实验中发现，对FXR基因敲除的肥胖小鼠实施垂直型袖状胃切除术（verticalsleevegastrectomy，VSG)，其术后减重和改善葡萄糖耐受的作用大大下降，而VSG术后效果与胆汁酸代谢密切相关，研究指出FXR调节通路可能是减重手术重要的分子基础。由此，推测BA-FXR通路是减重手术改善T2DM的重要环节。综上，糖尿病是一种多致病因素共同参与下形成的，目前虽然治疗方式很多，但要从根本上治愈糖尿病，还未找到真正有效的方式。减重手术在其减重的同时，起到显著改善甚至治愈2型糖尿病的目的，故逐渐应用于临床。然而由于手术治疗糖尿病的作用机制不明，目前国内实施该手术还未得到推广。因此在手术确切疗效的同时，研究其内在机制，也是实施该治疗2型糖尿病方式的必要前提。本5 序言胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响实验通过构建动物2型糖尿病胃转流手术模型，研究胆汁酸在手术前后的变化以及相关糖代谢因子的改变，探讨胃转流术治疗2型糖尿病的潜在机制。为进一步对临床糖尿病患者外科治疗提供实验理论基础，为外科手术治疗2型糖尿病的临床应用提供理论依据。6 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响材料与方法材料与方法1.材料与仪器1.1主要实验材料SD大鼠(Sprague-DawleyRats）上海西普尔-必凯实验动物有限公司GuggulsteroneTocrisBioscience公司GW4064TocrisBioscience公司Dimethylsulfoxide(DMSO)Sigma公司链脲佐菌素100mgSigma公司总胆汁酸（TBA）测试盒南京建成生物工程研究所总胆固醇（TCH）测定试剂盒浙江东瓯诊断产品有限公司甘油三酯（TG）测定试剂盒浙江东瓯诊断产品有限公司1.1.2.2PCR所有试剂TrizolInvitrogen公司氯仿（Trichloromethane，三氯甲烷）上海凌峰化学试剂有限公司异丙醇（iso-Propylalcohol）上海凌峰化学试剂有限公司无水乙醇（Ethanol）上海展云化工有限公司PrimeScript™1stStrandcDNASynthesisKitTaKaRa公司SYBR®PremixExTaq™(TliRNaseHPlus)TaKaRa公司1.1.2.3Westernblotting试剂：甲醇上海展云化工有限公司RIPA裂解液(RIPALysisBuffer)Beyotime公司PMSF蛋白酶抑制剂（Phenylmethanesulfonylfluoride）Beyotime公司BCA蛋白浓度测定试剂盒Beyotime公司PierceECLWesternBlottingSubstrateThermoscientific公司PEPCK单克隆抗体（sc-32879）SANTACRUZ公司G6Pase-αAntibody(H-60)（sc-25840）SANTACRUZ公司7 材料与方法胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响Glut2Antibody(H-67)(sc-9117)SANTACRUZ公司FXR(NR1H4)Antibody(ab126602)ABACAM公司β-TubulinMonoclonalAntibody（二抗）Abbkine公司GAPDHMonoclonalAntibody（二抗）Bio-TNT公司1.2主要实验仪器BL-150电子分析天平德国Sartorius公司SANNUO血糖仪中国三诺公司SANNUO血糖试纸中国三诺公司制冰机日本SANYO公司超净工作台苏州医疗设备厂84-1A多功能磁力搅拌器上海司乐仪器有限公司Benchmark酶标仪美国BIO-RAD公司台式高速冷冻离心机德国KendroLib公司低温冰箱MDF日本SANYO公司MLS-3020高压蒸汽灭菌器日本SANYO公司普通离心机上海医用离心机厂ES-C200A电子秤湘仪天平仪器厂ASP300型全自动脱水机德国Leica公司DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱上海恒科学仪器有限公司TH-35602100型电压锅日本TSAOHSINPYX-DHS型恒温箱上海跃进医疗器械厂BX71荧光显微镜日本OLYMPUSSCS-24型电动摇床上海离心机械研究所Tanon-4100全自动数码凝胶图像分析系统上海圣科仪器设备有限公司AWP-2-75G分析型实验室纯水机艾科浦公司VENTICELL自然对流干燥箱德国MMM公司转膜仪美国Bio-RadmultisKanFC酶标仪美国ThermoElectron超声波组织匀浆仪美国Bilong-96II8 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响材料与方法紫外一可见光分光光度计美国Agilent公司细胞培养箱美国NAPCO公司Real-timePCR扩增仪美国ABI7500公司酶标仪美国Beckman公司其他仪器与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，封口膜，搪瓷盘，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸等。1.3试剂配制（一）母液1、1.0mol/LTris·HCl(pH=8.8)Tris(MW121.14)121.4g蒸馏水800-900ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用蒸馏水定容至1L，高温灭菌后室温下保存。2、1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）Tris(MW121.14)121.4g蒸馏水800-900ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至1L，高温灭菌后室温下保存。3、1.74mg/ml(10mmol/L)PMSFPMSF0.174g异丙醇100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。4、10％SDSSDS10g蒸馏水至100ml50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。5、10％过硫酸胺（APS）过硫酸胺0.1g超纯水1.0ml9 材料与方法胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响溶解后，4℃保存，保存时间为1周。6、30％Acr/Bic（29：1）购自美国Bio-rad公司丙稀酰胺（Acr）29g甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g超纯水至100ml37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。7、20％Tween20购自Abcam公司Tween2020ml蒸馏水至100ml混匀后4℃保存。（二）使用液1、单去污剂裂解液（50mmol/LTris·HClpH8.0，150mmol/LNaCl，1％TritonX－100，100μg/mlPMSF）：1mol/LTris·HCl（pH8.0）2.5mlNaCl0.438gTritonX－1000.5ml蒸馏水至50ml混匀后，4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl）。2、G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝G250：100mg95％乙醇：50ml磷酸：100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。3、0.15mol/LNaClNaCl（MW58.44）0.877g蒸馏水至100ml10 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响材料与方法高温灭菌后，室温保存。4、100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）BSA0.1g0.15mol/LNaCl1ml溶解后，－20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15mol/LNaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。5、分离胶和浓缩胶分离胶浓度8%10%12.5%30%w/v丙烯酰胺:双丙烯酰胺1.5ml1.87ml2.34ml1.0MTris-ClpH8.83ml3ml3ml10%SDS75μ175μ175μ1dH2O2.88ml2.51ml2.04ml混合,灌胶前加入APS和TEMED10%APS(过硫酸胺)37μ137μ137μ1TEMED5μ15μ15μ1总体积7.5ml7.5ml7.5ml浓缩胶浓度4%6%30%w/v丙烯酰胺:双丙烯酰胺550μ1750μ11.0MTris-ClpH6.8630μ1630μ110%SDS50μ150μ1dH2O3.74ml3.54ml混合,灌胶前加入APS和TEMED10%APS(过硫酸胺)25μ125μ1TEMED5μ15μ1总体积5ml5ml注：4%浓缩胶配合<10%的分离胶使用,6%浓缩胶配合>10%的分离胶使用。6、还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/LTris·HClpH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）2.5ml11 材料与方法胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39gSDS0.5g溴酚蓝0.025甘油2.5ml混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。7、10ⅹ电泳液缓冲液（25mmol/LTris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％SDS）Tris（MW121.14）15.1g甘氨酸（MW75.07）72gSDS5g蒸馏水至500ml溶解后室温保存，使用时将其稀释10倍，次溶液可重复使用3～5次。8、10ⅹ转移缓冲液（48mmol/LTris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇）甘氨酸（MW75.07）2.9gTris（MW121.14）5.8gSDS0.37g甲醇20ml蒸馏水至100ml溶解后室温保存，使用时将其稀释10倍，次溶液可重复使用3～5次。9、10ⅹTBS缓冲液（Tris,pH7.2,5mol/LNaCl）Tris6.05NaCl150ml蒸馏水至350ml溶解后室温保存，使用时将其稀释10倍。10、10ⅹTBST缓冲液20％Tween201.0mlTBS1000ml混匀后即可使用，最好现用现配。12 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响材料与方法11、封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌）5gTBST100ml溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。12、化学发光显影液（PierceECLWesternBlottingSubstrate）蛋白转移膜曝光显影时，按照A液：B液=200ul:200ul(1:1)的比例配制，现配现用。13、抗体用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜平均约需0.5ml。1.4实验对象健康雄性SD大鼠(Sprague-DawleyRats）12只，6周龄，体重180.2士6.4g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。1.4.1实验动物选择的原因本实验采用SD大鼠进行高脂饮食喂养，联合腹腔注射低剂量的链脲佐菌素制备2型糖尿病大鼠模型，比之自发性进行链脲佐菌素腹腔注射获得的2型糖尿病大鼠模型，能较好的模拟人类2型糖尿病的病动物模型如GK大鼠，其优点在于价格便宜，且SD大鼠更易获得。1.4.2实验动物的饲养环境SD大鼠在无特定病原体(SpeceficpathogenFree,SPF)中进行饲养，明暗周期12小时交替，温度19-26℃，相对湿度40%-70%，自由进食和饮水。适应性饲养1周后采用随机数字表法分为高脂组和普饲组，高脂组8只，普饲组4只，4只/笼，5%苦味酸标记大鼠皮肤序号，必要时补充染色。实验地点：上海第六人民医院动物房和糖尿病研究所，实验条件及实验过程均符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条件》。1.4.3实验动物的饲料配方及营养成分(1)普通饲料:普通混合饲料88.5%，猪油10%，胆固醇1%，猪胆盐0.5%。(2)高脂饲料:普通混合饲料54.6%、猪油16.9%、蔗糖14%、酪蛋白8.2%、预混料2.1%、胆固醇2%、麦芽糊精2.2%。2方法2.12型糖尿病大鼠模型的建立13 材料与方法胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响高脂组大鼠给予持续高脂饲料喂养8周后，禁食12小时，不禁水，按35mg/kg一次性右下腹腹腔注射1%STZ溶液。注射后自由饮水，禁食12小时后继续予以高脂饮食。2型糖尿病大鼠成模标准：注射STZ3日后用一次皮试针头穿刺采取大鼠尾静脉血(约10u1)用于监测空腹血糖，持续一周空腹血糖>7.1mmo1/L认为成功建立大鼠T2DM模型。2.2实验动物分组随机抽取造模成功的肥胖大鼠分为:高脂组（high-fatdiet，HFD，n=4）和高脂手术组（high-fatdietfollowedbyGastricbypass,HFD-GBP,n=4），正常对照组（normalchowdiet,NCD,n=4）。2.3实验动物的手术方式及术后饲养HFD-GBP组和HFD组各自行GBP术和腹腔探查术（不改变胃肠道解剖），术后禁食3天，给予20%葡萄糖溶液饮用，3天后给予普通饲料饮食喂养，直至实验结束；NCD组按术前原来各自饮食喂养不变，直至实验结束。2.4建立大鼠胃转流术模型2.4.1术前准备所有大鼠术前均禁食16小时、不禁水；术前补液采用颈背部多部位皮下注射0.9%生理盐水，每个部位注射量不应超过2mL，共注射0.9%生理盐水15mL；麻醉后用左手固定大鼠，使其腹部向上正对操作者，用1mL注射器于右下腹缓慢刺入腹腔后，注入1%戊巴比妥钠(0.5ml/100g体重)，注意进针不能过深以免损伤大鼠腹腔内脏器导致大出血或死亡，术中若发现大鼠出现挣扎时可追加少量麻药滴入腹腔，以满足手术要求；术前大鼠采用肌肉注射青霉素用以预防感染，计量按5万IU/100g体重。2.4.2手术操作过程及注意事项14 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响材料与方法胃转流手术模型图2胃转流术示意图15 材料与方法胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响图3手术操作过程示意图HFD-GBP组大鼠手术方式选择切除远端胃大部的胃转流手术。具体操作如下：(a-b)麻醉成功后，腹部备皮，将大鼠固定于手术台上。术野常规碘伏消毒后，铺无菌洞巾。（c）取上腹正中切口约5cm，上至剑突，下至脐部，依次切开皮肤、皮下组织，钝性分离肌肉，打开腹膜。（d-e）分离并4-0丝线结扎胃周韧带与血管。（f-g）于胃小弯处距食管胃交界处3-5mm向大弯侧斜行断胃。（h-l）断端以5-0丝线连续缝合关闭，并以4-0丝线间断缝合加强，旷置远端胃大部，保证留下的胃小囊约占胃总容积的20%。（i-k）旷置十二指肠+近端1/5空肠，即距离屈氏韧带10cm处离断空肠。（l-q）空肠远端与残胃行侧端吻合16 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响材料与方法（r-t）空肠近端与胃肠吻合口以远15cm处行端侧吻合。（u-v）各组关腹前用生理盐水擦拭腹腔，检查有无活动性出血。以3-0丝线关闭腹膜及腹肌，4-0丝线间断缝合皮肤，并予以碘伏消毒皮肤切口。（w）术毕,解除固定并移至独立清洁鼠笼，保持大鼠呼吸道通畅，密切观察至其麻醉完全苏醒，并用烤灯复温，待大鼠麻醉完全苏醒后，需与其他大鼠隔离饲养。术中注意事项：手术切口宜选择5cm左右大切口，既有利于充分暴露术野，也避免切口对肠管的卡压导致肠管缺血坏死，术中注意保护胃周的血管，注意观察肠管的颜色有无变化，防止肠管坏死的发生；手术在确保吻合口可靠的情况下应尽量控制手术时间在100分钟以内；手术时若发现大鼠出现挣扎，应立即追加少量麻药滴入腹腔，以满足手术要求。手术耗时：胃转流术约80-100分钟。2.4.3术后大鼠的处理(1)HFD-GBP组大鼠术毕给予皮下注射生理盐水15mL进行补液，皮下注射青霉素用以预防腹腔内感染及皮肤感染，计量按5万IU/100g体重。(2)手术当日禁食禁饮，术后起每天给予皮下注射生理盐水15mL进行补液，皮下注射青霉素用以预防腹腔内感染及皮肤感染，计量按5万IU/100g体重，从第二天起同时给予20%葡萄糖加强补液以防体液失衡，术后第四天起待排便后开始正常饮食。2.5实验观察指标及检测方法2.5.1体重和血糖造模前、术前和术后每周禁食12h后，用电子称称量在每周固定时间点水平测定各组大鼠在安静状态下的体重，并经尾静脉采血测定各组大鼠空腹血糖浓度，记录值精确至0.1g。2.5.2采血采血前大鼠禁食12小时，用2.5ml注射器心脏采血（图4）2mL于EP管，使用血糖仪测量大鼠空腹血糖,将采集血静置30min后经4℃低温离心机离心l0min(3000r/min)，收集上层血清至两EP管，一份用生化试剂盒酶标仪测定检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、胆汁酸，17图4心脏采血 材料与方法胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响另一份保存-80℃冰箱，备用。2.5.3葡萄糖耐量实验（OGTT）和胰岛素糖耐量实验（ITT）葡萄糖耐量实验（OGTT）：术前一周，大鼠禁食不禁水12h，按2g/kg剂量，用50％葡萄糖溶液灌胃，于0h、0.5h、1h、2h分别尾静脉采血测血糖浓度。胰岛素糖耐量实验（ITT）：术前一周，隔夜禁食不禁水12h，诺和灵R(0.5U/kg)腹腔注射(诺和灵0.9%NS稀释100倍后注射)，于注射前、注射后30min、60min、120min时分别尾静脉采血，测定血糖浓度。2.5.4处死大鼠术后2周，采用心脏注射空气的方法处死各组大鼠，提取大鼠肝脏组织，贮存于液氮罐中，备用。2.5.5酶标仪测定血清胆汁酸、总胆固醇、甘油三脂水平①总胆汁酸试剂盒胆汁酸水平a.测定前配制试剂一应用液，按照A液(磷酸盐缓冲液PH7.5，黄递酶，氧化型辅酶I):B液(碘化硝基四氮唑盐)=9：1比例，将试剂一B液倒入试剂一A液中，混合均匀，配制试剂一反应液（R1）。b.首先分别取10μl标准品和待测样品加到微孔板中，再分别加入80μlR1，混匀，37℃孵育3-5min，酶标仪下测定505nm波长，读取吸光度A1。c.随后向上述混合液中再加入试剂二反应液R2（磷酸盐缓冲液PH7.5，3α-羟类固醇脱氢酶）20μl，混匀，37℃孵育3-5min，酶标仪下测定505nm波长，读取吸光度A2。d.根据两次读数得出△A=A2-A1，根据血清样本计算公式：TBA含量（µmol/L）=△A测定/△A标准×标准品浓度（µmol/L），得出待测样本胆汁酸含量。②总胆固醇和甘油三酯水平测定a.准备微孔板，分别标为空白管（B）、标准管（S）、测定管（T）。b.首先分别取3μl标准品和待测样品分别加到S和T微孔板中，然后向三管中再分别加入300μl总胆固醇测定试剂/甘油三酯测定试剂，混匀，置37℃水浴5min，以空白管校零，在酶标仪下测定546nm波长，读取吸光度值At和As。c.根据计算公式：总胆固醇/甘油三酯含量（mmol/L）=At/As×标准品浓度（mmol/L），得出待测样品浓度。18 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响材料与方法2.5.6WesternBlotting检测组织标本蛋白水平取采集的所需大鼠肝脏组织保存于液氮中，用WesternBlotting法检测肝脏FXR、PEPCK蛋白相对表达情况。以GAPDH或β-tublin作为内部参考。①提取蛋白a.取适量肝脏组织剪切成细小的碎片，置于圆底Eppendorf管中。b.融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。c.按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。d.用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。e.充分裂解后，4℃预冷后的离心机中10000-14000转/分钟离心3-5分钟，取上清，转移到新的Eppendorf管中，放置于-20℃，备用。②BCA蛋白质定量实验步骤：a.稀释待测蛋白：取3μl待测蛋白，加入蒸馏水至60μl，稀释20倍；b.稀释BSA蛋白标准液：取10μl标准液，加入蒸馏水至100μl，稀释10倍；c.以试剂A：试剂B=50：1的比例配置BCA工作液，每孔需200μl；d.按照0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl向微孔板中加入标配准液，后每空加入PBS至总体积为20μl；e.分别吸取20μl稀释后待测蛋白溶液到微孔板的对应孔中；f.分别吸取200μlBCA工作液加入到每孔中，混合均匀；g.用锡箔纸封闭微孔板后置于孵育箱中，37℃孵育50分钟；h.冷却至室温；i.应用Nanodrop2000系统测量562nm附近的各孔吸光度；j.计算待测样品孔的平均光吸光度与空白孔平均光吸收值的差值；k.使用BSA标准蛋白562nm测量值对其浓度(ug/ml)绘制出标准曲线，通过标准曲线定量待测样品蛋白浓度；③SDS-PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。19 材料与方法胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响（2）灌胶与上样a、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。b.制备10%浓度分离胶(pH8.8)，总体积为7.5ml；缓慢加入分离胶到装配好的板中至约6cm高，预留1.5cm高度。加入适量甲醇到每板凝胶溶液上，静置20分钟左右。c.制备4%浓度浓缩胶(pH6.8)，使用滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，将浓缩胶加入板中至顶端，凝胶聚合20分钟左右。然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。d.用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。e.测完蛋白含量后，计算含50μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。f.加足够的电泳液后微量进样器开始准备上样。（3）电泳开始80V电压，电泳时间0.5h，当电泳至分离胶时，换电压为120V电泳1.5h。电泳至溴酚兰刚跑出即蛋白完全跑开，可终止电泳，进行转膜。（4）蛋白质转膜a.准备好蛋白转移装置夹板；b.按如下顺序依次装配:吸水纸-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-吸水纸。c.将夹板放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用100V转移1.5h。（5）膜的封闭和抗体孵育a.膜在5％脱脂奶粉溶液中室温孵育封闭1小时，再用TBST液洗膜3次，每次10min。b.分别加入一级抗体:PEPCK（1：500）、G6Pase-α（1：500）及Glut2（1：500）、FXR(NR1H4)（1：5000）、GAPDH（1：5000）、β-Tublin（1：500）4℃孵育过夜后室温孵育1h，4℃过夜。再用TBST液洗膜3次，每次10min。c.加入HRP标记的二级抗体（1：5000），再在室温下孵膜1小时。用TBST液洗膜3次，每次10min。20 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响材料与方法（6）化学发光，显影在暗室、避光的环境中，将ECL蛋白显影液A液和B液等体积混合至EP管中，将膜放置于玻璃板上，吸水纸将残余水吸净，然后吸取一定量显影混合液滴在膜的表面，使其覆盖整个膜。静置1min，曝光显影，并拍照。（7）凝胶图象分析运用分析软件Gel-Proanalyzer4分析条带灰度值计算蛋白相对表达量。2.5.7组织标本RT-PCR检测mRNA水平实验采取适量大鼠肝脏组织标本，检测各组大鼠肝脏中FXR、PEPCK、G6Pase、GLUT2和FGF-21相对表达情况。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内部参照，-△CTmRNA相对表达量=2×100%,△CT=目标基因CT值-内参(β-actin)CT值。①PCR实验前的准备：从液氮中取出所用量各组大鼠肝脏组织，转移至5ml玻璃试管中。②组织总RNA的抽提a.分别加入1mlTrizol到每一试管中；b.将标本用电动匀浆器匀浆30s(8000r/min)；c.将匀浆液转移至1.5mlEppendorf管中；d.加入氯仿200μ1至各试管中，摇匀15秒，室温孵育2-3min；e.4℃条件下将标本离心15min(12000r/min)；f.吸出标本上层转移至准备好相对应的Eppendorf管中，再加入500μ1异丙醇，室温孵育10min；g.4℃条件下将标本离心10min(12000r/min)，丢弃上清液保留下面沉淀；H.各标本加入与Trizol等体积的75%乙醇洗涤沉淀，涡旋样本后，4℃条件下将标本离心10min(12000r/min)；i.将标本真空或空气下干燥；j.重悬RNA：用DEPC处理水溶解标本中RNA，并用移液枪吹打混匀，保存于-20℃冰箱中。③逆转录cDNA逆转录反应体系的配置：将试剂盒从-80℃冰箱取出，复融，将经过稀释后的RNA样本进行RT，反应体系如下：21 材料与方法胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响a.5×DNAEraserBuffer4μ1gDNAEraser2μ1TotalRNA总量≤1ug，根据测定的RNA浓度计算所加体积DEPC处理水补至10μ1总体积10μ1反应条件:42℃,2min或者常温下5min；b.a中反应液10μ15×PrimeScriptBuffer4μ1RTPrimeMix1μ1PrimeScriptRTEnzyme1μ1DEPC处理水4μ1总体积20μ1反应条件：37℃，15min；85℃，15s。④Real-timePCR反应a.引物序列FXRSequence(5’—>3')ForwardprimerGCCTCTGCTCGATGTCCTACAReverseprimerGGAGGCAGGCGAAATGCTPEPCKSequence(5’—>3')ForwardprimerGCCTGTGGGAAAACCAACCTReverseprimerCACCCACACATTCAACTTTCCAFGF-21Sequence(5’—>3')ForwardprimerACCGGAGTCAGAACACAATTCCReverseprimerAACTCTAGATCTCATCCATTCCATCAG6PaseSequence(5’—>3')ForwardprimerCCCAGACTAGAGATCCTGACAGAATReverseprimerGCACAACGCTCTTTTCTTTTACCGLUT2Sequence(5’—>3')22 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响材料与方法ForwardprimerTGACCGAAGAGCTACCATTAACTATGReverseprimerGTGTCGTATGTGCTGGTGTGACTβ-ACTINSequence(5’—>3')ForwardprimerCGACAGCAGTTGGTTGGAGCReverseprimerGGTCTCAAGTCAGTGTACAGb.将制备好的cDNA进行PCR扩增，扩增体系如下：SYBRGreenMix5μ1上游引物F0.5μ1下游引物R0.5μ1ddH20水3μ1cDNA模板1μ1总体积10μ1将PCR板置于按照反应条件：95℃5min预变性95℃5s变性60℃30s退火72℃1min延伸，共40个循环c.数据采用仪器自带软件分析:ABIPrism7500SDSSoftware3统计学处理方法采用GraphPadPrism5软件进行统计学处理，结果以⎺x±s表示，各组手术前后数据比较采用配对t检验，组间均数比较采用one-wayANOVA单因素方差分析法。p<0.05为有统计学差异,P<0.01认为有显著性统计学差异。23 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响实验结果实验结果2.1构建2型糖尿病大鼠模型高脂组高脂喂养大鼠4周，各组大鼠体重、血糖均无统计学差异（图5A，5B；p>0.05）。高脂组腹腔注射STZ后，HFD血糖明显升高，糖耐量和胰岛素敏感性明显降低（图5C，5D；p<0.05）。50020NCDNCD400HFDHFD*15300*10200Weight(g)10050012468Bloodglucose(mmol/L)002457time(W)time(w)ABOGTTITT2510*NCDNCD*HFD**HFD208**15*6*10452Bloodglucose(mmol/L)0Bloodglucose(mmol/L)000.51.02.000.512time(h)time(h)CD图52糖尿病大鼠模型的相关指标检测注：与正常对照组比较，p<0.052.2手术前后大鼠体重和血糖的变化与术前（0周）相比，HFD-GBP组术后1周体重及空腹血糖显著降低（p<0.05），NCD和HFD组同时间点体重和血糖与0周比较无差异（p>0.05）。见表1、表2和图6A、6B。24 实验结果胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响表1手术前后大鼠体重比较（⎺x±s，g）组别0周1周2周NCD363.6±18.8374.4±19.3386.5±19.6HFD426.6±22.7440.8±21.4453.5±20.9HFD-GBP428.8±21.5405.6±20.3*420.7±19.8注：与术前同组比较，*p<0.05表2手术前后大鼠空腹血糖比较（⎺x±s，mmol/L）w组别0周1周2周NCD4.4±0.54.2±0.44.4±0.2HFD11.7±3.212.4±2.411.6±3.5HFD-GBP11.6±3.48.2±1.7*6.8±1.5*注：与术前同组比较，*p<0.05NCDHFDHFD-GBPNCDHFDHFD-GBP50020****45015400103505Weight(g)30000week1week2weekBloodglucose(mmol/L)0week1week2weekAB图6手术前后大鼠空腹体重和血糖比较注：与术前同组比较，*p<0.052.3各组大鼠血清总胆汁酸、胆固醇、甘油三酯水平手术组术后2周，3组大鼠血清总胆汁酸含量：NCD组为44.43±11.52μmol/L，HFD组48.08±2.490μmol/L，HFD-GBP组107.1±5.107μmol/L。3组大鼠血清总胆固醇含量：NCD组为1.557±0.1607mmol/L，HFD组1.937±0.4483mmol/L，HFD-GBP组1.424±0.1057mmol/L。3组大鼠血清甘油三酯含25 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响实验结果量：NCD组为1.479±0.2341mmol/L，HFD组2.915±0.1406mmol/L，HFD-GBP组1.269±0.2818mmol/L。与NCD和HFD组大鼠相比，HFD-GBP大鼠血清总胆汁酸水平显著升高，差异具有统计学意义（t=5.054,p<0.05;t=10.39,p<0.01）；见图7A。与NCD组相比较，HFD组的血清总胆固醇和甘油三酯水平明显升高，差异具有统计学意义（t=3.7982,p<0.05;t=4.065,p<0.05）；与HFD组相比，HFD-GBP组血清总胆固醇和甘油三酯水平显著降低，差异具有统计学意义(t=3.115,p<0.05;t=50230,p<0.01),见图7B、7C。NCDHFDHFD-GBPNCDHFDHFD-GBP150*3****100250100NCDHFDHFD-GBPNCDHFDHFD-GBPserumbileacids(umol/L)totalcholesterols(mmol/L)ABNCDHFDHFD-GBP4**3210triglycerides(mmol/L)NCDHFDHFD-GBPC图7各组大鼠血清总胆汁酸、总胆固醇、甘油三脂水平注：与不同组间同一时间点相比较，*p<0.05，**p<0.012.4引物特异性验证对设计的引物通过普通PCR和凝胶电泳进行特异性分析（图8A、8B）。26 实验结果胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响AB图8普通PCR溶解曲线(A)和PCR产物凝胶电泳(B)2.5各组大鼠肝脏组织中FXR的表达变化3组大鼠肝脏FXRmRNA相对表达量：NCD组为3325±589.8，HFD组5093±532.8，HFD-GBP组8835±165.6。FXR蛋白相对表达量：NCD组为1.201±0.634，HFD组为6.230±3.265，HFD-GBP组为3.723±0.808。FXRmRNA表达NCD组与HFD组无统计学差异（t=2.015,p>0.05），NCD和HFD-GBP组差异有统计学意义（t=8.994,p<0.01）；HFD分别和HFD-GBP组差异有统计学意义27 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响实验结果（t值分别为t=4.645；p<0.05），见图9A。FXR蛋白相对表达NCD组与HFD组、HFD-GBP组差异有统计学意义（t=1.834,p<0.05;t=3.473,p<0.05）；HFD组和HFD-GBP组差异无统计学意义（t=0.912,p>0.05），见图9B、9C。NCDHFDHFD-GBPNCDHFDHFD-GBP***810000**80006600044000protein2ofFXRmRNA2000relativeexpressionratio(FXR/GAPDH)of00NCDHFDHFD-GBPNCDHFDHFD-GBPAB图93组大鼠肝脏组织中FXR表达注：与正常组比较，*p<0.05。与高脂组比较，**p<0.01。2.6各组大鼠肝脏组织中PEPCK的表达变化3组大鼠肝脏PEPCKmRNA相对表达量：NCD组为47460±3643，HFD组为49850±1480，HFD-GBP组为68940±2667。PEPCK蛋白相对表达量：NCD组为1.538±1.907，HFD组为3.694±2.470，HFD-GBP组为3.284±0.749。PEPCKmRNA表达NCD组与HFD组无统计学差异（t=2.015,p>0.05），NCD和HFD-GBP组差异有统计学意义（t=4.475,p<0.05）；HFD分别和HFD-GBP组差异无统计学意义（t值分别为t=0.693；p>0.05），见图10A。PEPCK蛋白相对表达NCD组与HFD组、HFD-GBP组差异有统计学意义（t=1.063,p<0.05;t=1.204,p<0.05）；HFD组和HFD-GBP组差异无统计学意义（t=0.218,p>0.05），见图10B、10C。28 实验结果胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响NCDHFDHFD-GBPNCDHFDHFD-GBP150000**6*1000004500002PEPCKmRNAofproteinrelativeexpressionof00NCDHFDHFD-GBPratio(PEPCK/β-Tublin)NCDHFDHFD-GBPAB图103组大鼠肝脏组织中PEPCK表达注：与正常对照组比较，p<0.052.7各组大鼠肝脏组织中G6Pase、GLUT2及FGF-21mRNA的表达变化3组大鼠肝脏G6PasemRNA相对表达量：NCD组为28430±2599，HFD组10400±738.7，HFD-GBP组为14610±3207。FGF-21mRNA相对表达量：NCD组为337.4±24.1，HFD组172.9±78.65，HFD-GBP组254.3±6.077。GLUT2mRNA相对表达量：NCD组为1041±58.67，HFD组864.0±52.23，HFD-GBP组3931±188.6。G6Pase和FGF-21mRNA各组间差异无统计学意义（p>0.05），见图11A、11B。GLUT2mRNA表达NCD组与HFD组无统计学差异（p>0.05），NCD、HFD分别和HFD-GBP组相比较（t=3.463,p<0.05；t=4.185,p<0.05），差异均有统计学意义。见图11C。29 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响实验结果NCDHFDHFD-GBPNCDHFDHFD-GBP600006004000040020000200G6PasemRNAFGF21mRNArelativeexpressionof00NCDHFDHFD-GBPrelativeexpressionofNCDHFDHFD-GBPABNCDHFDHFD-GBP8000**600040002000GLUT2mRNArelativeexpressionof0NCDHFDHFD-GBPC图113组大鼠肝脏组织中G6Pase、FGF-21和GLUT2mRNA的表达注：与正常组比较，*p<0.05。与高脂组比较，*p<0.0530 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响讨论讨论糖尿病是一种发病机制复杂、严重危害人类身心健康并且难以治愈的顽疾，一旦发病需要终身服药或使用胰岛素控制血糖，生活质量受到严重影响。目前2型糖尿病的治疗方法，主要包括饮食控制、运动疗法、药物治疗及胰岛细胞移植治疗、干细胞疗法等新兴疗法。但饮食控制一方面需要将各种营养素在种类上合理搭配，另一方面还要求各种营养素在数量上要严格控制，因为不同年龄段、不同性别、伴随不同并发症的糖尿病患者其临床表现个体差异性较大，治疗要根据个体制定具体的个人膳食计划，这使患者不容易达到理想的饮食控制要求，使得许多患者无法按要求并且坚持长期的执行。而适度的运动对降低血糖作用有限，且同样不能长期坚持。药物治疗糖尿病则主要包括各种口服降血糖药及胰岛素的应用。口服降糖药主要包括磺脲类、双胍类、α-葡萄糖糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂及胰岛素等。虽然药物治疗是目前临床最常用的治疗方法，但也存在暂时控制血糖，且不能使血糖稳定控制及阻止各种并发症的发生和进展，同时伴随有各种不足之处，如低血糖、胃肠道反应，需终身服药等。胰岛素治疗虽具有快速的降糖效果，但容易引起低血糖和高胰岛素血症等严重并发症，甚至危及到患者的生命且长期注射胰岛素治疗糖尿病，给患者带来了诸多的不便和巨大的身心痛苦。新兴的疗法包括胰岛细胞移植治疗及干细胞疗法，但尚有其不尽人意之处，诸如存在供体不足、长期使用免疫抑制剂的副作用、伦理及费用昂贵等各种难题，目前仍难以推广。目前T2DM患病率的变化有五大共同特点：第一，患病率的急剧增加；第二，T2DM占糖尿病患者的大多数；第三，发病年龄的年轻化；第四，糖调节受损（impairedglucoseregulation，IGR）的人群威胁；第五，各地发病状况的巨大差异和医疗水平的参差不齐，而引发整体调控性差。面对如此形势，寻找一种新的有效、理想、安全的治疗手段成为亟待解决的问题。近年来，胃转流术（gastricbypass，GBP）用于治疗肥胖型及非肥胖型2型糖尿病（type2diabetesmellitus，T2DM）的日益增多,其治疗作用已在国内外得到广泛印证。胃转流术主要从三个方面对血糖产生影响，其一，GBP改变正常了消化道解31 讨论胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响剖结构；其二，GBP旷置大部分远端胃和空肠近端，一方面使食物不接触部分小肠和胃，另一方面使食物提早到达远端小肠。其三，胃肠道分泌的内分泌激素如GLP-1、PYY、GIP等，在GBP术后其分泌受到影响，从而调节血糖水平。目前临床实践表明GBP术已基本成熟，其疗效也得到了国内外的肯定。然而，迄今为止，GBP的残胃容量以及吻合口位置的具体标准仍未得到统一。因此，寻找一种最佳的手术方案已成为使GBP治疗T2DM得以广泛应用的前提。GBP术用于治疗T2DM已逐渐被医学界所熟知，尤其对肥胖合并T2DM的患者效果更显著，术后在体重下降的同时，血糖也得到了明显改善。然而其内在作用机[7]制仍在研究当中。Mingrone等在随机对照研究中，将60例伴有T2DM的病态肥胖患者随机分为内科治疗组、胃转流术组及胆胰转流术组，研究术后T2DM缓解率，结果2年时内科治疗组缓解率为0，胃转流术组及胆胰转流术组分别有[15-16]75%和95%。Schauer等研究也发现减肥手术+内科治疗明显优于单独内科治疗。可见，一定时间内减肥手术是可以治疗T2DM。虽然减重手术在治疗糖尿病中疗效显著，但是，减重手术治疗糖尿病的作用机制仍未揭晓。手术前后胃肠[27]道激素，胆汁酸代谢，肠道菌群的变化，是目前研究的热点。PournarasDJ等在人体和动物研究中得出GBP术后血清胆汁酸水平升高，可刺激肠道胰高血糖素样肽-1（Glucagon-likePeptide-1，GLP-1）、Peptide-YY（PYY）等激素分泌，[31]进而达到改善T2DM的效果。RyanKK等在袖状胃切除术肥胖小鼠模型中发现，术后小鼠体重下降的同时，循-环中胆汁酸水平增加，肠道微生物菌群也发生了[32-33]显著变化。Turnbaugh,P.J等则将肥胖小鼠的肠道微生物移植到无菌小鼠中，无菌小鼠体重增加。而从GBP术后小鼠中移植的微生物却减慢了体重的增加[34]。可见，减重手术可通过影响胃肠道激素，胆汁酸代谢、肠道菌群变化等多方面的作用改善糖尿病。现就目前胃转流术后缓解2型糖尿病作用机制大致如下：减少热量摄入和减重:胃转流手术最早应用于减肥，认为术后体重下降与糖[8-10]尿病患者术后病情缓解有关，但是很多研究显示术后血糖改善早于体重下降。可见，GBP术还有其它机制比减肥本身迅速缓解或改善糖尿病。肠道内分泌激素改变：1)胰高血糖素样肽-1（Glucagon-likePeptide-1，GLP-1）主要是由末段回肠L细胞合成分泌，有促进胰岛素分泌、促进胰腺β细胞增生并抑制其凋亡、加强组织摄取和利用葡萄糖、抑制胃排空和小肠运动、减慢32 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响讨论小肠对营养物质的吸收、抑制胰高血糖素分泌、增加胰岛素的基因表达等作用。T2DM患者中肠促胰岛素效应受损，导致进餐后GLP-1分泌减少，而GBP术后食物快速到达末端回肠，刺激L细胞分泌GLP-1，促进胰岛素分泌，并改善胰岛素抵抗等，[35][36]从而引起血糖降低，即“后肠假说”。Meirelles等对肥胖伴胰岛素抵抗的GK大鼠实施GBP术后发现，血糖下降的同时，伴随着GLP-1水平的升高，胰岛素抵抗也得到明显改善，该实验结果肯定了GLP-1在GBP治疗T2DM机制中的重要性。[37]临床研究也显示GBP术后的T2DM患者餐后GLP-1的分泌成倍增加。现阶段已有GLP-1受体激动剂（利拉鲁肽等）和DDP-IV抑制剂（西格列汀等）应用于临床。因此，GLP-1被认为是胃肠激素中调节糖代谢的最核心的介导因子。2）Peptide-YY（PYY）是一种主要由末段回肠L细胞经餐后食物刺激分泌的能产生厌食效应的信号肽，能产生饱胀感，抑制胃的排空及胃肠蠕动，进而影响食欲，减少营养物质摄入，增加糖耐量，参与血糖的调节。研究表明GBP术后的T2DM患者餐后PYY[38]分泌明显增加，其可能是源于术后完全未消化的食物提前刺激末端回肠促进其大量分泌，持续的厌食效应导致的食欲减退和摄入减少，从而达到控制血糖的目的。而伴肥胖的T2DM患者GBP术后PYY水平明显增加，胰岛β细胞及胰岛素的敏感[39][40]性也得到了长期改善。HansenCF等近期通过大鼠实验发现，GBP术后小肠黏膜肥大伴L细胞数量成倍增加（而密度不变），并且整个肠道PYY基因表达水平增加近200%，这可能解释PYY在GBP术后调节糖代谢的重要作用。3）肠抑胃肽（GastricInhibitoryPolypeptide，GIP）是由十二指肠和上段空肠的上皮K细胞分泌，可促进胰岛β细胞葡萄糖依赖性地释放胰岛素。而T2DM患者由于存在肠-胰岛轴的异常活化，导致GIP水平增高，产生过多的胰岛素，形成胰岛素抵抗。[41]Rubino则通过GK大鼠实验提出了“前肠学说”，认为近端小肠分布大量K细胞，食物可刺激其释放大量GIP，造成胰岛素抵抗，从而导致T2DM。而GBP术后，食物避开了对近端小肠的刺激，GIP分泌明显减少，从而使胰岛素抵抗减轻，血糖水平也得到控制。但近来研究发现GBP术后T2DM患者的GIP基因表达水平比术前增加[42]4.36倍，而非糖尿病患者增加2.21倍。也有研究显示伴肥胖的T2DM患者GBP术[43]后GIP的分泌有增加、减少或不变。因此，GIP在GBP术中的确切作用尚无定论。4）生长激素释放肽（Ghrelin）Ghrelin是一种主要由胃幽门D1细胞和P细胞分泌，是唯一促进食欲的胃肠肽。Ghrelin受体在胰腺β细胞也有表达，而β细胞33 讨论胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响是糖代谢的关键，因此，认为Ghrelin对血糖调节也发挥重要作用。研究发现，当给正常人体注入外源性Ghrelin后，会导致内源性胰岛素分泌减少，最终影响[44]血糖调节。食源性减肥的肥胖患者在减重的同时，血浆Ghrelin水平升高，而[45]肥胖和正常体重者GBP术后血浆Ghrelin水平与术前相比减低。但也有研究得出[46]术后血浆Ghrelin的水平反而增加或无明显变化。可见，Ghrelin在GBP术缓解糖尿病中无足轻重。肠道菌群的改变：肠道微生物群的作用是宿主与微生物群的交互作用调节宿[47]主的代谢。据报道GBP术后，不管是在啮齿动物还是在人类，肠道菌群发生了[31]大量变化。在一项涉及人类、大鼠、小鼠的研究中，GBP术诱发肠道变形菌和[48]疣微菌门大量增加。最近一项研究表明，抗糖尿病药物二甲双胍，使大鼠肠道突柄杆菌属大量增加。然而，是否二甲双胍和Roux-en-Y胃分流术对肠道微生物[31]群产生类似影响以改善糖代谢是不确定的。RyanKK等在袖状胃切除术肥胖小鼠模型中发现，术后小鼠体重下降的同时，循-环中胆汁酸水平增加，肠道乳球[32-33]菌属和埃希氏杆菌属也显著增加。Turnbaugh,P.J等则将肥胖小鼠的肠道微生物移植到无菌小鼠中，无菌小鼠体重增加。而从GBP术后小鼠中移植的微生[33]物却减慢了体重的增加。GBP术通过改变宿主菌群减轻体重的分子机制仍难以[33]捉摸，肠道菌群引起短链脂肪酸的变化也许扮演重要角色。尽管肠道菌群改变与GBP术后体重下降和血糖改善的关系是不确定。然而，宿主与肠道菌群之间相互作用的改变也必定是探索糖尿病和肥胖治疗机制的重要方向。胰腺B细胞功能及肝脏和外周胰岛素敏感性改变：肥胖性2型糖尿病患者GBP或SG术后GLP-1增加，随后胰腺β细胞功能改善，而β细胞血糖敏感性却[34,49,50]达不到正常状态。β细胞血糖敏感性被报道是GBP术后糖尿病缓解的主要决定因素。胰高GLP-1拮抗剂exendin9-39可降低患者餐后胰岛素的分泌，这表明β细胞功能的恢复很大程度上通过增加GLP-1来实现。GBP术后各组织胰岛素的敏感性变化不同。肝脏术后一周内的胰岛素敏感性得到显著，并可持续一年，而外周组织的胰岛素敏感性包括骨骼肌和脂肪组织在[51]术后早期不变，后期才有所增加。改善肝胰岛素敏感性对于体内正常葡萄糖代谢至关重要，由于它会导致肝葡萄糖的产生下降。肝脏的胰岛素敏感性在术后体重下降之前就得到了显著改善。尽管GBP术后改善肝胰岛素敏感性的确切机制仍34 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响讨论[52]然是未知的，肝内脂肪含量降低可能与术后胰岛素敏感性增加有关。GBP术后有很多改善胰岛素敏感的性的机制，体重下降本身可以增加胰岛素敏感性。总而言之，GBP术后肝胰岛素敏感性提高，这在很大程度上是由于热量限制，而外周胰岛素敏感性逐渐改善与体重下降一致。脂肪因子的作用：1）瘦素（Leptin）是由白色脂肪细胞分泌的一种蛋白质类激素，其中皮下脂肪组织表达最多。Leptin可抑制食欲，减少能量摄入；增加能量消耗；抑制脂肪合成。生理情况下胰岛素能够促进脂肪的合成，而脂肪分泌的Leptin能反馈抑制胰岛素的分泌，使脂肪组织合成减少，分解增加。而病理状态下，Leptin对胰岛素分泌抑制减轻，随之出现高胰岛素血症及胰岛素抵抗。T2DM患者的Leptin水平增高，而Leptin水平的变化与体重指数（bodymassindex，[53]BMI）并没有独立的关系。但有研究发现，在肥胖女性人群中Leptin仅与BMI[54]显著相关。实施GBP的肥胖患者术后Leptin水平（19.8±6.7）比术前（59.0[55]±5.1）明显下降。而伴肥胖的T2DM患者GBP术后12个月血清Leptin水平相对基[56]线水平显著下降，术后空腹血糖、胰岛素水平及胰岛素抵抗也明显降低。由此推断T2DM患者GBP术后血糖的控制可能与Leptin水平下降解除了胰岛素抵抗有关，但并不排除手术前后体重变化的影响。2）脂联素（adiponectin）adiponectin是一种由脂肪组织表达和分泌的内源性胶原蛋白。研究证实adiponectin能提高胰岛素的敏感性，而adiponectin水平降低可以加剧胰岛素抵[57]抗。给予正常体重及肥胖者注射adiponectin后发现，血糖下降，而且胰岛素[58][59]敏感性也得到提高。Hindle等研究发现肥胖及伴肥胖的T2DM患者adiponectin的表达较非糖尿病者明显下调，伴肥胖的T2DM患者下调更明显，而GBP术后adiponectin的表达显著上调，并接近正常对照组水平。而肥胖型T2DM患者GBP术后7天adiponectin水平未见明显变化，术后90天空腹血糖显著降低，[60]而餐后adiponectin水平明显升高，由此认为术后adiponectin表达升高可能与T2DM缓解有关。3）此外脂肪素(Visfatin)、Chemerin、Nesfatin-1等脂肪细胞因子也发现可能与糖代谢有关。[61]炎症细胞因子的作用：在小鼠和人类中研究证实FGF-15或FGF-19参与体内[62]肠肝循环，并可以逆转饮食诱导的糖尿病，而且在小鼠实验中能促进糖原合成。FGF-19和FGF-21转基因小鼠在抑制食物诱导肥胖同时，可以提高胰岛素敏感性和35 讨论胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响[63-64]促进糖利用。将FGF-15重组蛋白注射进糖尿病小鼠体内，可以引起小鼠血糖[65-66]和胰岛素浓度下降，并可以改善糖耐量，减轻脂肪肝，降低体重。而近期有[67]临床研究显示糖尿病患者（n=66）比非糖尿病患者（n=54）有更低的FGF-19和更高水平的胆汁酸，而实施胃转流术糖尿病患者术后糖尿病缓解的同时，FGF-19明显增加，肝脏组织胆固醇-7α羟化酶（cholesterol7alpha-hydroxylase1，CYP7A1）基因表达也增加，由此考虑FGF-19可能通过FGF19–CYP7A1–BA途径调节GBP术后糖代谢。此外也有研究认为FGF-21也可能[68][69]是通过FGF-21–CYP7A1–BA途径发挥糖调节作用。此外，临床研究显示TNF-α、IL-6等炎症因子在GBP术后甲基化作用增加，可能发挥改善能量代谢的作用。胆汁酸代谢改变：胆汁酸是胆固醇的终产物，由肝脏中合成，储存在胆囊中，进食后排入肠道，促进食物中脂类的乳化和吸收。同时，肝脏也是糖异生的主要场所。研究表明，胆汁酸不仅可以调控脂类代谢，还可以作为信号分子参与糖代[70]谢的调控。胆汁酸的“肝肠循环“是调节胆汁酸合成速率的重要调节机制。相[71]关研究发现，T2DM患者行GBP术后，胆汁酸合成增加，血浆胆汁酸水平也随之升高，并认为术后胆汁酸的变化影响GLP、PYY等胃肠激素的变化。单纯性肥[72]胖患者GBP术后空腹血糖及胰岛素抵抗降低，而胆汁酸水平比术前明显增加。此外，胆汁酸可以作为配体与相应受体结合后发挥作用，与核受体FXR或G蛋白[72]耦合受体TGR5结合可分别通过调解基因组和非基因组以影响胆汁酸。例如术后通过BA-FXR-（肝脏或肠道）-CYP7A1-BA增加肝脏对胰岛素或其他激素的敏感性和途径调节术后病理变化和糖尿病缓解；通过BA-TGR5（肠道）-GLP-1增加胰[73]岛素的敏感性和胰岛素的产生。近期，一项动物研究发现GBP手术可能通过抑制肝脏糖异生和促进肠道糖异生的双重作用影响术后血糖的调节。因此胆汁酸代谢在GBP术后糖代谢中的作用值得深入研究。本实验通过建立2型糖尿病GBP模型观测GBP对糖代谢的影响，发现GBP在早期减轻体重和改善血糖水平的同时，血清胆汁酸水平也显著升高，其中术后胆固醇和甘油三脂水平显著下降，肝脏中相关糖代谢因子也发生变化。FXR即法呢醇X受体，在肝脏，小肠等器官中高表达。生理情况下，胆汁酸可激活FXR，因此也被称为胆汁酸受体。近年来研究发现胆汁酸-FXR信号通路可能在减重手36 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响讨论[31]术治疗糖尿病中发挥重要作用。本研究发现，胃转流术在早期改善糖尿病的同时，术后肝脏组织中FXR的表达水平显著提高，说明FXR对糖代谢发挥重要作用。[74]PEPCK是糖异生中的关键酶，主要在肝脏中表达。Ma等发现胆汁酸通过FXR途[75]径抑制糖异生限速酶PEPCK的表达，而Stayrook等研究发现FXR能通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisomeproliferatoractivatedreceptor-α,PPARα）而上调PEPCK的表达。本研究初步探索发现，与非手术相比，胃转流术后在改善糖代谢同时，肝脏中PEPCK的表达增加。因此，可推断PEPCK也参与术后糖代谢稳态。此外，实验显示G6Pase术后也有增加趋势,这可能与术后肝脏糖异生得到改善有关。GLUT2是介导葡萄糖摄取的膜蛋白，是肝脏、[76]胰岛β细胞小肠等器官或细胞最主要的葡萄糖转运体。在新西兰肥胖小鼠以及[77]Zuker肥胖糖尿病大鼠等多种糖尿病动物模型中,胰岛β细胞GLUT2的表达减少。在这些模型中胰岛β细胞GLUT2的减少与葡萄糖刺激下胰岛素分泌能力下降密切相关。我们目前发现胃转流术后的2型糖尿病大鼠肝脏中GLUT2mRNA[78]表达上调。但GLUT2是如何参与术后糖代谢，还需进一步研究。实验研究发现2型糖尿病患者行GBP术后血清中胆汁酸水平升高，血清中FGF-21也增加，由此推断术后FGF-21对糖代谢发挥有利影响。总之，胃转流术已成为一种有效的干预2型糖尿病的手术方式，其作用机制值得我们去探究，以期望在糖尿病的治疗方式上有更新的突破。我们的研究发现，GBP在减重的同时，能够调节胆汁酸代谢，改善机体的胰岛素抵抗，使早期2型糖尿病大鼠血糖恢复至正常水平。对这一调节过程继续进行深入的研究，不仅有可能改变当前我们对2型糖尿病发病机制的认识，甚至彻底改变该病的治疗方法。相信随着基础研究和临床工作的不断深入，对GBP手术治疗糖尿病机制的了解会愈加透彻，也将为探索糖尿病的新型治疗方式指引方向，有助于我们寻找更加成熟的糖尿病治疗策略，稳定治疗效果，并且降低并发症的产生。外科治疗将成为糖尿病治疗的新时代选择。37 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响结论结论1、胃转流手术在早期就可以减轻体重和改善2型糖尿病。2、胃转流术后胆汁酸水平明显增加，可能参与术后2型糖尿病血糖改善。3、胃转流术后大鼠肝脏组织表达FXR水平显著增加，可能是胆汁酸参与血糖调节的关键环节。4、胃转流术后肝脏组织PEPCK、G6Pase、GLUT2等相关糖代谢因子发生变化，手术可改变肝脏糖异生关键酶的表达影响糖代谢，从而进一步改善2型糖尿病。38 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胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响攻读硕士期间已发表的论文攻读硕士期间发表的论文目录*1、李旭忠,胡承,张学利.胃转流手术治疗2型糖尿病机制的研究进展.中华老年多器官疾病杂志,2014(8),628-631*2、李旭忠，颜勇，周舟，邱文娟，周联明，黄忠明，胡承，张学利.胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响.中华老年多器官疾病杂志,2015(1),71-7648 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响致谢致谢本研究课题是在导师张学利教授的严格要求和精心指导下完成的。三年来我耳濡目染了导师崇高的敬业精神，严谨的治学风范，忘我的工作精神和诲人不倦的作风，这一切必将使我终生受益，是我一生学习的榜样。在此，谨向导师致以最崇高的敬意和衷心的感谢！导师严谨的治学态度、严谨的工作作风、高尚的为人品格是我一生学习的楷模。尤其衷心感谢胡承教授在课题设计及实验操作中的指导，从实验设计到具体方法直至论文的完成，胡教授都给予了极大的帮助。尤其在科研创新方面，胡教授给予了我最强有力的支持和帮助，循循善诱的指导启发我的科研思路，鼓励我积极参与科学研究工作，使我学到了宝贵的知识，锻炼了能力，这些令我终生难忘！感谢周舟博士在课题实验工作中给予最真诚的帮助。感谢周玉龙师兄对动物胃转流手术模型建立的指导，感谢孔凡志师师兄、李芳师姐等所有同门师兄弟对我的关心和帮助，感谢江枫硕士、严婧硕士等在实验中给予的指导和帮助。并感谢2012届苏州大学同学在我学习和实验中的帮助。本课题的主要工作于上海交通大学附属第六人民医院糖尿病研究所进行，实验期间，尊敬的胡承教授、陆俊茜老师、张蓉老师等为课题的完成提供了技术先进、设备优良的实验平台。在此谨致以最诚挚的敬意，正是有大家无私的支持和帮助，实验才能如期进行，顺利开展。教授们广博学识、严谨作风和学者风范永远是我学习的楷模。衷心感谢感谢上海交通大学附属第六人民医院南院（上海市奉贤区中心医院）普通外科杨治老师、黄忠明老师等全体医护人员对我在学习和临床实践中给予的大力支持和帮助！感谢检验科主任冯景副院长、科教科刘梅科长对我学习和生活的关心和照顾。感谢我的家人和我在家乡的朋友们，千里长路隔不断关爱和思念，亲情是伴我一生最完美的珍藏。纸短情长，难忘的三年学习时光匆匆逝去，我还要深深地感谢所有默默关心过我的人，我将带走诸位的关心，留下我最真诚的祝福。最后，再次向给予我关心、帮助、支持的老师、同事和朋友表示衷心地感谢！祝福各位生活顺心，身体49 致谢胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响健康，事业有成！李旭忠2015年4月50 胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响附录附录英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称DMDiabetesmellitus糖尿病T2DMType2diabetesmellitus2型糖尿病GBPGastricBypass胃转流术RYGBRoux-en-YgastricbypassRoux-en-Y胃转流术LRYGBLaparoscopicRoux-en-Y腹腔镜Roux-en-Ygastricbypass胃转流术JIBJejuno-ilealbypass空回肠转流术SGSleevegastrectomy袖状胃切除术VSGVerticalsleevegastrectomy垂直型袖状胃切除术AGBAdjustablegastricbanding可调性胃束带术BPDBiliopancreaticdiversion胆胰转流术DSDuodenalswitch十二指肠转位术SPFSpeceficpathogenFree无特定病原体STZStreptozocin链脲佐菌素BABileacid胆汁酸CYP7A1Cholesterol7α-hydroxylase1胆固醇-7α羟化酶TCHTotalcholesterolthegroups总胆固醇TGTriglyceride甘油三酯FPGFastingplasmaglucose空腹血糖51 附录胃转流手术对糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关因子表达的影响BMIBodyMassIndex体重指数OGTTOralglucosetolerancetest口服糖耐量试验ITTInsulintolerancetest胰岛素耐量实验FXRFarnesoidXreceptor法呢醇X受体PEPCKPhosphoenolpyruvate磷酸烯醇式丙酮酸Carboxykinase羧基酶G6PaseGlucose-6-phosphatase葡萄糖6磷酸酶GLUT2Glucosetransporter2葡萄糖转运蛋白2FGF-21Fibroblastgrowthfactor-21成纤维生长因子21GAPDHGlyceraldehyde-phosphate甘油醛-3-磷酸dehydrogenase脱氢酶HFDHigh-fatdiet高脂组HFD-GBPHigh-fatdietfollowed高脂手术组byGastricbypassNCDNormalchowdiet正常对照组GIPGastricinhibitorypolypeptide抑胃肽GLP-1Glucagon-likepeptide-1胰高血糖素样肽-1PYYPeptide-YY多肽YYGGhrelin生长激素释放肽PProbability概率NCDnoncommunicablediseases非传染性疾病52