口虾蛄卵黄蛋白原基因cdna全长序列的克隆及表达分析

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1、分类号密级UDC编号硕士学位论文口虾蛄卵黄蛋白原基因cDNA全长序列的克隆及表达分析张娜1222010指导教师姓名刘海映教授专业名称渔业资源论文答辩日期2015年6月3日学位授予日期2015年6月日MolecularcloningandexpressionofafulllengthcDNAencodingVitellogenin(Vg)inOratosquillaoratoriaAThesisSubmittedtoDalianOceanUniversityInFulfillmentoftheRequirementfor

2、theDegreeofMasterZhangNaSupervisor:LiuHaiyingCommencedin:June,2015Completedin:June,2015摘要摘要口虾蛄(Oratosquillaoratoria)是我国沿海重要的海产经济甲壳动物之一，是具有极高经济价值的优良品种。近年来由于过度捕捞和海区环境的破坏，致使其资源量减少，对其进行人工繁育和资源保护势在必行，而进行人工繁育和资源保护的前提是了解其繁殖发育规律，这包括了解与繁殖有关基因的时空表达模式。本研究以口虾蛄繁殖发育中重要基因——卵黄蛋

3、白原基因为研究对象，对其进行克隆和表达分析，以期丰富口虾蛄繁殖生物学的研究内容，为全面了解口虾蛄的繁殖规律，进而进行人工繁育和资源保护奠定重要基础。在动物繁殖发育中，卵黄蛋白原(Vitellogenin，Vg)是存在于非哺乳类卵生动物成熟雌性个体中的一种蛋白，是卵黄蛋白(Vitellin,Vn)的前体。卵黄是卵生动物卵巢以及卵中的主要物质，卵黄蛋白是构成卵黄的主要部分，并在卵黄发生期迅速积累。在卵生动物中，Vg不仅为成熟的卵母细胞发育成胚胎提供蛋白质、糖类、脂肪以及其他营养物质，还2+3+2+2+2+能结合金属离子（例

4、如Zn,Fe,Cu,Mg,Ca）并作为载体携带它们进入到卵母细胞中。卵黄蛋白原在卵黄发生期能携带类胡萝卜素、甲状腺素、视黄醇、核黄素进入卵母细胞。此外，卵黄蛋白原还具有免疫防御功能。迄今为止甲壳类卵黄蛋白原的研究主要集中于十足目甲壳动物，尚未发现口足目口虾蛄卵黄蛋白原的研究，考虑到卵黄蛋白原在繁殖发育中的重要作用，对口虾蛄的卵黄蛋白原基因进行克隆与表达分析显得非常重要。本实验利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）首次成功克隆获得口虾蛄(Oratosquillaoratoria)卵黄蛋白原（Vitellogenin，V

5、g）基因的cDNA全长序列。且应用相对实时荧光定量PCR技术首次检测口虾蛄卵巢不同发育时期Vg基因的表达量。序列分析结果表明：Vg基因全长7727bp（GenBank登陆号：KR422400），其中5’端非编码区36bp，开放阅读框（ORF）7521bp，3’端非编码区170bp，共编码2506个氨基酸。系统发育分析结果表明,克隆所得口虾蛄Vg基因和十足目虾蟹类Vg基因亲缘关系较近，符合甲壳动物的最新分类系统。其开放阅读框编码的氨基酸序列和其他已知十足目卵黄蛋白原序列在NCBI上进行数据库比对（BLASTP）存在46%

6、~52%的相似性，且含有4个已知功能结构域：参与脂质转运的卵黄蛋白原N端结构域（Vitellogenin_N）和脂蛋白（Lipoprotein）N端结构域（LPD_N），以及2个血管性血友病因子（vonWillebrandfactor）D型结构域（VWD）。实时荧光定量PCR分析结果表明,口虾蛄Vg基因的表达量随着卵巢发育的进程显著升高（P<0.05），在成熟期时达到最高值，随后显著下降（P<0.05），未发育期时的表达量最低。由此可知，口虾蛄卵巢从未发育到产卵后的消退期，Vg基因的表达量呈现规律性的变化，表明卵巢在经

7、过一个卵黄合成旺盛期后，进入到休整阶段，为下一次发育做准备。关键词:口虾蛄；卵黄蛋白原；基因克隆；定量PCR；表达分析IAbstractAbstractOratosquillaoratoriaisanimportantmarinecrustaceanswithahigheconomicvaluethatlivesalongthecoastofChina.Inrecentyears,duetooverfishingandmarineenvironmentdamaging,theamountofOratosquillaor

8、atoriaresourcesisreducingdecreasingly,breedingandconservationofresourcesarenowusedbyartificialmearsures.Weexpectedthevitellogeningenecloningandexpressionasastartingpo