SelS保护ECV304细胞免于过氧化氢损伤与窖蛋白1的关系研究

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学乏敝储虢岿签字日期：丛年』月竺日学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的

2、全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。SelS保护ECV304细胞免于过氧化氢损伤与窖蛋白．1的关系研究硕士研究生：赵音指导教师：杜建玲教授指导小组：邢倩副教授专业名称：内科学摘要目的：从人脂肪组织中克隆SelS基因片段，构建pcDNA3．1一SelS真核表达载体。将pcDNA3．1．SelS瞬时转染至人脐静脉内皮细胞株(ECV304)中，分别从mRNA水平及蛋白水平检测SelS基因在ECV304细胞中的表达。瞬时转染后将ECV304细胞分为未转染组、SelS转染组(SelS高表达组)及空载体转染组，以不同浓度的过氧化氢(H

3、202)损伤后，观察各组细胞损伤前后的氧化应激指标及窖蛋白．1(Caveolin-1．．Cav．1)表达水平的差异，探讨Caveolin．1是否与SelS抗氧化作用有关。为深入研究SelS内皮保护的作用机制提供新的实验依据。方法：1．采用RT．PCR方法从人脂肪组织中获取SelS基因片段(79-645bp)，通过两次亚克隆将目的基因克隆于pcDNA3．1真核表达载体中，获得真核表达载体质粒pcDNA3．1．SelS，并行EcoRI／XhoI酶切鉴定及测序鉴定。2．应用脂质体转染技术分别将pcDNA3．1一SelS及pcDNA3．1瞬时转染至ECV304细胞中，从而将ECV304

4、细胞分为SelS转染组及空载体转染组，同时以未转染组ECV304细胞作为对照。以GAPDH为内参照半定量检测SelSmRNA水平的表达；以3-actin为内参照，Westernblot方法检测SelS蛋白水平的表达。3．各组细胞分别经含有终浓度为0、400、600、800、l000pmol／L的H202的培养液作用6小时后，四甲基偶氮唑蓝法(MTT)观察H202对细胞增殖能力的影响：取不同浓度各组细胞上清液，硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)的含量，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力。4．根据MTT结果，选取细胞生存率适度减低的含H202浓度800pmol／L的培

5、养液作用各组细胞6小时后，提取各组细胞总RNAt采用RT．PCR方法检测各组细胞Caveolin．1的niRNA表达水平。结果：．．1．从人脂肪组织中提取的总RNA是完整的，SelS基因cDNA测序结果与Genebank中的序列(NM．018445)相一致。经XhoI和EcoRI酶切及测序鉴定证实peDNA3．卜SelS真核表达载体质粒构建成功。2．RT．PCR、Westernblot检测证实SelS在ECV304细胞中有内源性表达，同时半定量分析显示SelS转染组的SelSmRNA及蛋白表达水平均较未转染组及空载体转染组明显升高(P

6、异(PO．05)。4．MDA含量(nmol／mL)：各组细胞上清液中MDA的含量随着H202浓度的升高而增加；在H202浓度为600、800、l0001,tmol／L时，SelS转染组的MDA水平(3．50-4-0．07，

7、6．304-0．07，10．50+0．08)均低于未转染组(6．404-0．03，10．40+0．11，18．00士O．07)及空载体转染组(5．80+0．08，9．00-4-0．09，l6．40+0．19)，H202浓度为10001,tmol／L时差异更为显著(PO．05)。5．SOD活力(U／mI)：各组细胞上清液中SOD的活力随着H202浓度的升高而减弱；在H202浓度为600、800、l000p,mo