基于GFP的FRET监测树突棘钙动力学

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1、*摘要细胞内钙离子作为传递信息的第二信使对细胞生长分化起着重要作用神经系统中神经递质的合成与释放细胞间信息传递树突的生长树突棘的形成及突触可塑性等都与细胞内钙离子有着密不可分的关系研究表明树突棘内的钙离子参与调控多种信号途径并且对长时程增强LTP和长时程抑制LTD有着重要贡献而LTP和LTD目前被认为是学习和记忆的神经基础因此监测海马神经元单个树突棘的钙浓度变化是研究突触可塑性分子和细胞机制的关键激光共聚焦显微镜和钙离子荧光探针的发展实现了生理状态下树突棘内钙信号的检测激光扫描共聚焦显微镜具有散射背景小色差小分辨率高等优势基因探针是内源性

2、大分子对细胞钙动力学影响小同时采用Ratio成像可以定量探测钙离子浓度本实验使用基于GFP的钙离子基因探针Cameleon来研究了树突棘的钙动力学首先优化了细胞培养磷酸钙转染方法使用458nm激光代替430nm激光来进行荧光共振能量转移FRET探测然后比较了不同Cameleon的动态范围458nm激发时YC2.1YC6.1和YC3.60FRET比值的变化范围分别为33%70%220%最后初步完善了FRET定量钙浓度的方法应用于1静息状态下的钙分布在静息状态下海马神经元的胞体一级树突二级树突三级树突和树突棘内钙离子浓度分别为10422nM7

3、110nM556nM407nM5614nM树突棘的钙离子浓度高于对应的树突证实了树突颈扩散屏障的功能同时发现静息状态下树突棘内钙离子浓度分布范围13~80nM这种钙离子浓度的差异可能与树突棘的成熟度功能以及钙运作方式等有关2生理刺激对胞体和树突棘内钙离子浓度的影响吹加谷氨酸来研究了神经元的胞体和树突棘的钙动力学在100μM的谷氨酸的刺激下胞体内钙离子浓度从100nM上升到1μM左右而树突棘内钙离子浓度从50nM上升达到500nM结果表明利用Cameleon的FRET比值变化来定量监测树突棘钙动力学的方法是切实可行的并可以进行实时无损长时间

4、的监测为研究神经递质动作电位等刺激对树突棘内钙信号影响提供一种重要研究手段关键词海马神经元树突棘钙离子浓度CameleonFRET*本课题得到国家自然科学基金批准号3017030630370463以及国家海外杰出青年科学基金批准号30328014的资助IIIAbstractCalciumion,asasecondmessenger,playsakeyroleincellulargrowthanddifferentiation.Innervoussystem,calciuminvolvesinsynthesisandreleaseofneu

5、rotransmitter,andsignaltransmission,dendriticgrowth,andspineformation,aswellasinsynapticplasticity.Previousstudiesindicatethatexcitatorysynapticactivityevokescalciumiontriggersdiversesignalingpathwaysthroughinfluxintospine.Someresultsfromothergroupsshowthatfreecalciumiona

6、ccumulationinspineisrequiredtoinducemostformsoflong-termpotentiationanddepression,whicharemolecularmechanismofmemoryandlearning.Quantitativemeasurementofcalciumdynamicsinsinglespinesiscrucialtounderstandingthecellularandmolecularmechanismunderlyingthesynapticplasticity.Co

7、nfocalmicroscopyandcalciumindicatorsareusedtomonitorthephysiologicalcalciumsignalinspine.Confocalmicroscopyhaspredominancesinaberration-freeimageandidealresolutionandcontrast.GECIisanendogeneticbiomacromolecule,soitaffectslittlecalciumdynamics.Ratioimagingcanmeasurecalciu

8、mconcentrationquantitatively,atthesametime,itcanavoidfeintoffluorescenceintensitychangeduetobase