氨基肽酶抑制剂乌苯美司诱导人骨髓瘤细胞凋亡的研究

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1、英文缩略语ll中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：蒸龇匕日期：嵫t墨中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。

2、本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：刀阮·中文论著摘要·氨基肽酶抑制剂乌苯美司诱导人骨髓瘤细胞凋亡的研究刖吾多发性骨髓瘤(MulipleMyeloma)是血液系统的一种恶性肿瘤，和其他恶性肿瘤一样，它的发生、发展与细胞凋亡紊乱有密切关系。CDl3是一种细胞膜糖蛋白，又名氨基肽酶N(Aminopept

3、idaseN)，因能够从肽、酰氨和芳酰氨的N端水解氨基酸残基而得名。CDl3是最早被认定的正常或恶性髓性细胞的表面标志物，多年来用于对白血病或淋巴瘤细胞的定性和分型。CDl3并非仅在髓性细胞才表达，许多其他类型的细胞在其生长周期的某个阶段均可表达CDl3。文献表明已检测到骨髓瘤细胞可以高度表达CDl3，这为CDl3抑制剂乌苯美司靶向治疗多发性骨髓瘤提供了分子生物学的依据。CDl3在机体组织细胞之间的生理调节和信号传递过程中起着至关重要的作用，可以水解某些与免疫功能有关的细胞因子，不利于正常免疫功能的发挥。随着对CDl3研究的不断深入，越来越多的证据表明，CDl3与肿瘤的发生和发展有着密

4、切的关系：CDl3可以增强细胞侵袭性，有利于肿瘤转移；可以促进肿瘤新生血管形成；还可促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡。CDl3抑制剂乌苯美司(Ubenimex)是从网状橄榄链霉菌培养液中发现的一种具有抗菌作用和免疫增强作用的小分子二肽化合物，能抑制肿瘤细胞表面氨基肽酶B．N．和亮氨酸氨基肽酶，诱导肿瘤细胞凋亡和促进宿主免疫功能，具有直接和以宿主为中介的抗肿瘤活性作用。乌苯美司有明确的抗肿瘤活性，早期认为，在体内主要是通过非特异性促进抗肿瘤免疫反应实现的。后来研究发现，体外试验在不含有巨嗜细胞、T细胞等免疫细胞的条件下，乌苯美司仍然可以抑制数种肿瘤细胞生长，促进凋亡。乌苯美司对慢性白血

5、病(CML)细胞株(K562)具有抗增殖和诱导凋亡的作用，抗增殖作用与细胞周期蛋白D1(cyclinD1)表达下降有关，而诱导凋亡机制是通过半胱天冬酶一3(Caspase-3)信号途径和P13K-GSK信号途径实现的。近年来，国外有少数报道在体外对肿瘤细胞株及白血病细胞株有直接的生长抑制作用，但有关乌苯美司对骨髓瘤细胞的作用研究报道罕见。本实验研究了乌苯美司对人骨髓瘤细胞xG及RPMl8226的抑制作用，观察了乌苯美司是否具有诱导人骨髓瘤细胞凋亡的作用，希望能为寻求多发性骨髓瘤新的治疗手段提供一些线索。实验材料与方法一、实验材料人骨髓瘤细胞株XG及RPMl8226。二、实验方法1、细胞

6、培养两种细胞均常规培养，xG添加浓度为5ng／ml的rhIL一6，3-4天换液传代一次。实验时均用对数生长期细胞。2、药物浓度设定根据预实验及文献报道，设定MTT实验中乌苯美司的终浓度为30ug／ml、125ug／ml、500ug／ml、2000ug／ml。原位细胞凋亡检测及流式细胞仪检测中乌苯美司的浓度均为1000ug／ml。3、细胞生长检测(MTT法)取对数生长期的细胞，新鲜培养液洗后，调整细胞数为1×105个细胞／ml，接种于96孔培养板，每孑LlOOul，接种同时加不同浓度的药物100ul，每浓度平行6孔，空白对照用等体积的RPMI1640，周围一圈加等体积的PBS液减少边缘效

7、应。置37。C，饱和湿度，含5％CO：的细胞培养箱培养24、48、72h。各孔加MTT工作液(5mg／m1)20ul，置37。C细胞培养箱共同培养4h，取出1000转／分离一tl,10分钟，扣板，加入150ulDMS0，震荡使沉淀充分溶解，混匀。用酶联免疫检测仪(DG3022A型)检测，读取490nm处的光密度值(oD)，计算抑制率。抑制率(％)=(空白对照的0D值一实验孔的0D值)／空白对照的oD值*100％4、凋亡检测2(1)DNA片段原位