罗汉果果实内生真菌的分离及其抗氧化活性研究

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1、单位代码10602学号2015011102分类号Q93-3密级公开硕士学位论文罗汉果果实内生真菌的分离及其抗氧化活性研究IsolationofEndogenousFungiofSiraitiaGrosvenoriandAntioxidantActivityofFermentationProducts学院：生命科学学院学科名称：生物学研究方向：生物化学与分子生物学年级：2015级研究生：范彩琴指导教师：赵丰丽教授完成日期：2018年6月教授II罗汉果果实内生真菌的分离及其抗氧化活性研究研究生：范彩琴年级：2015级导师：赵丰丽教授学科专业：生物学研究方向：生物化学与分子生物学摘要植物内生

2、真菌是高度多样性的微生物类群，其次级代谢产物丰富多样，具有合成与宿主植物相同或相似化学成分的能力。罗汉果(Siraitiagrosvenori)是我国传统的药食两用植物，罗汉果果实中的皂甙、多糖、黄酮等都具有很好的抗氧化活性。这表明罗汉果内生真菌可能产生具有抗氧化活性的代谢产物，可能是抗氧化活性物质的重要来源。本论文采用活性追踪的方法，对桂林龙胜县罗汉果内生真菌及其代谢产物进行研究。内容包括：新鲜罗汉果内生真菌的分离；抗氧化活性研究；活性成分的追踪与分离。研究主要内容和结果分析：1、罗汉果内生真菌的分离与化学成分预试验采用植物组织块切割法，从新鲜的罗汉果中分离出15株内生真菌，挑选10

3、株优势菌株进行菌落形态观察。将菌株接种于发酵培养基中26℃、170r/min摇床发酵6d，发酵结束后，减压抽滤分离发酵液与菌丝体。发酵液浓缩至浸膏，菌丝体50℃烘干，粉碎，再分别用石油醚、乙醇和水溶液提取，提取物进行化学成分预试验，初步了解菌株代谢产物所含的化学成分。实验结果可知，大部分内生真菌含有多糖、黄酮、蒽醌、有机酸等化学成分。2、活性菌株的筛选与鉴定采用清除1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)、清除羟自由基(·OH)和总还原力3种方法对10株内生真菌的发酵产物进行抗氧化活性的筛选。结果表明，10株内生真菌的发酵产物具有较强的总还原力和对DPPH·、·OH表现出良好的清

4、除力，最后筛选出一株发酵液和菌丝体都具有较强抗氧化能力的菌株F-5。当菌株F-5发酵产物浓度为1mg/mL时，发酵液对DPPH·和·OH清除率分别为74.09%和64.74%，菌丝体的清除率分别为73.56%和55.32%，小于同浓度Vc对DPPH·清除率(99.36%)和对·OH清除率(95.77%)。发酵液与菌丝体总还原力分别为1.547和1.241，大于同浓度Vc的总还原力(1.145)，数据表明F-5菌株具有较强的抗氧化活性。因此，选取III对自由基清除率最高的菌株F-5进行分子生物学鉴定。将菌株F-5在PDA培养基上划线，26℃培养4-5d，菌落生长较快，质地疏松，刚开始生长

5、的菌丝白色带黄色，随后变为淡绿色或者褐色。提取菌株F-5的DNA，采用通用引物进行18srDNA基因PCR扩增。测定结果显示，该序列长度为576bp。将序列通过BLAST和GenBank已有的序列进行比对，并构建系统发育树，可知该菌株与Aspergillusoryzae有99%的同源性，结合菌落形态观察，得出该菌株为米曲霉(spergillusoryzae)。3、菌株发酵条件优化采用单因素试验，研究碳源、氮源、发酵时间对菌株抗氧化活性的影响，并在单因素实验结果基础上，选择葡萄糖、蛋白胨、氯化钠和初始pH值四个因素设计正交实验，以发酵液对DPPH·和·OH清除率为实验指标，进一步优化菌株

6、抗氧化活性条件。结果表明，最佳氮源为蛋白胨，最佳碳源为葡萄糖，最佳发酵时间为6d，最佳初始pH值为6~7，菌株对自由基清除的影响因素依次为：氯化钠＞葡萄糖＞蛋白胨＞初始pH值。菌株F-5最佳优化条件为A4B1C1D2，即葡萄糖35g，蛋白胨2.0g，NaCl0.5g，初始pH值为6~7。此条件下对菌株F-5进行发酵验证，发现其对DPPH·和·OH清除率分别为97.53%和84.43%。说明菌株F-5发酵产生抗氧化活性成分的最佳条件为A4B1C1D2。4、抗氧化活性部位的筛选采用菌株F-5优化的条件进行发酵，发酵结束后，得到的发酵液采用液-液萃取法用石油醚、氯仿、乙酸乙酯三种有机溶剂按极

7、性由小到大对发酵原液进行萃取，回收有机溶剂，获得原液、3个萃取相和水相五种部分。采用3种方法测定5种浸膏的抗氧化能力并对其进行化学成分预试验，追踪抗氧化活性部位与成分。由结果可知，当样品浓度为1mg/mL时，乙酸乙酯相和水相对DPPH·清除率分别为76.88%、73.53%；对·OH清除率为62.21%、61.98%；总还原力为0.736、0.615。清除自由基能力高于其余三个萃取相，表明罗汉果内生真菌具有一定的抗氧化活性，其活性部位主要集中在