DEGS1抑制食管癌细胞的生长和转移及其相关机制研究

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1、浙江大学博上学位论文中文摘要DEGSl抑制食管癌细胞的生长和转移及其相关机制研究浙江大学医学院免疫学博士研究生周武导师张立煌教授中文摘要退行性精母细胞同系物1(DEGSl)最初是以表皮生长因子受体(EGFR)分子为“诱饵”通过酵母双杂交方法而筛选出来。我们首先通过免疫共沉淀(Co．IP)实验和pulldown实验证明DEGSl能与EGFR相互作用。荧光共振能量转移(FRET)实验进一步证明显示DEGSl在细胞内与EGFR有直接的相互作用。由于DEGSl与EGFR在细胞内、外都能发生相互作用，我们将这两个分子共转染HEK293T细胞以验证DEGSl是否会

2、影响EGFR的表达?共转染的实验结果显示，DEGSl的表达能抑制EGFR的蛋白表达而不影响其mRNA水平。这一点提示我们，DEGSl对EGFR的表达抑制不是在转录水平而是在翻译或翻译后的修饰方面。EGFR蛋白翻译后修饰的主要特点是蛋白表达后的泛素化过程。EGFR蛋白经过泛素化修饰后被运送至蛋白酶体进行降解。随后的泛素化实验证明，DEGSl的存在显著促进了EGFR蛋白的泛素化过程而与EGFR的磷酸化修饰无关。至此，我们了鳃到DEGSl能与EGFR相互作用并通过增加EGFR的泛素化程度而促进EGFR的降解，从而影响EGFR的蛋白水平。‘．EGFR及其家族成

3、员与肿瘤的关系密切，它们的表达影响着肿瘤病人的临床症状。EGFR在食管癌中有100％的高表达。而我们的实验证明，DEGSl能抑制EGFR的表达。于是我们想了解食管癌细胞中DEGSl与EGFR的表达模式及相互关系。我们检测了7株食管癌细胞系细胞，7株食管癌细胞系中EGFR的表达与DEGSl的表达呈反比例对应。即EGFR表达相对较高的细胞株其DEGSl表达相对较低，而EGFR表达相对较低的细胞株，其DEGSl表达相对则较高。为了更III浙江人学博士学位论文中文摘要加深入地研究DEGSl与食管癌的关系，我们选择食管癌细胞系Ecal09细胞进行进一步地研究。我

4、们构建了DEGSl过表达的Ecal09细胞稳定表达株，并运用慢病毒载体(Lentivirus)对本底的DEGSl水平进行RNA干涉。与对照细胞相比，DEGSl过表达Ecal09细胞的体外生长能力、体外克隆形成能力、细胞迁移能力下降，DEGSl的表达也抑制了Ecal09细胞的体内成瘤能力和体内转移的能力。相反，SiRNA下调DEGSl的表达后，Ecal09细胞的体外生长能力、克隆形成能力、细胞迁移能力以及体内成瘤和转移能力反而增强。这些实验证明，DEGSl在食管癌细胞中的表达影响了食管癌细胞的体内外生长、增殖和迁移的能力。为了进一步阐明DEGSl抑制食管

5、癌细胞生长、增殖及迁移的作用机制，我们首先检测了DEGSl对食管癌细胞的细胞周期的影响。我们将特异的DEGSl小分子RNA(SiRNA)克隆至慢病毒载体，293T中包装为成熟病毒后分别感染4株食管癌细胞Ecal09、Caesl7、KYSE．150和TE．12。用流式细胞仪对处与不同细胞周期的细胞进行记数。DEGSlSiRNA下调DEGSl的表达水平后，细胞周期中处于不同时期的细胞数目有所改变。与对照细胞相比，SiRNA下调DEGSl水平后的细胞处于S期的数目明显增多，其所占比例达到70％左右，而对照细胞中处于S期的细胞只有50％左右。另一方面，SiRN

6、A下调DEGSl水平后的细胞处于GO／G1期的比例为10％左右，比对照细胞的30％左右要少。另外，由于肿瘤的细胞的凋亡也会影响到它们的生长和增殖能力，我们也对DEGSl过表达的Ecal09细胞及其对照细胞的细胞凋亡情况进行了检测。AnnexinV／PI双染后，流式细胞仪检测发现，DEGSl过表达细胞中，凋亡细胞的比例增多。由此可见，DEGSl的表达加速了食管癌细胞系Ecal09细胞的凋亡。更重要的是，接下来的实验证明，DEGSl的表达诱导了半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族中的Caspase一6分子的表达。将DEGSl分子转染至食管癌Ecal09细胞

7、，Westernblotting检测几个caspase家族的分子的蛋白水平后发现，在相继的几个时间点上，只有Caspase一6分子的蛋白水平升高，而Caspase．3、Caspase．7和Caspase．8的蛋白表达没有变化。RT-PCR检测DEGSl过表达Ecal09细胞、DEGSlSiRNAEcal09细胞及其对照细胞的mRNA水平发现，DEGSl过表达Ecal09细胞中的Caspase．6mRNA水平比对照IV浙江大学博上学位论文中文摘要细胞高。相反，DEGSlSiRNAEcal09细胞中Caspase．6的mRNA水平则比对照细胞低。这些实验证

8、明，DEGSl的表达能诱导凋亡相关的Caspase．6分子的mRNA和蛋白的表达。由于DEGS