拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子至幼苗发育中导管分子的发生与连接

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1、http://www.paper.edu.cn拟南芥（Arabidopsisthaliana）种子至幼苗发育中导管分子的发生与连接毕冬玲汪矛*孔令安周树敏中国农业大学生物学院，北京100094.E-mail：wangmao5402@cau.edu.cn摘要拟南芥发育早期导管分子的发生与连接至今并不十分清楚。本文应用共聚焦激光扫描显微镜观察了野生型拟南芥种子至幼苗发育中导管分子的启动与连接。结果表明：种子萌发后2h，自第一个启动位点——子叶节区下部启动导管分子的分化，然后向下依次形成下胚轴和根的导管分子，再向上形成了子叶

2、节区中部的导管分子。种子萌发后10h，自第二个启动位点——子叶叶片中部偏下方启动导管分子的分化，并逐渐完成与子叶节之间的导管分子连接以及子叶叶片羽状环缘脉中导管分子的建成。种子萌发后7d，由上胚轴-苗区形成的导管分子向下与子叶节区上部形成的导管分子发生连接，至此形成该幼苗轴向和侧向器官中导管分子的完整连接。本研究揭示了拟南芥发育早期导管分子发育的时空性，可为生长素诱导导管分子分化的研究提供佐证。关键词拟南芥种子与幼苗导管分子发生连接1．引言植物维管系统具有运输物质、传递信息、机械支持和阻碍真菌及其它寄生物侵染等多[1]

3、种功能，因此研究维管系统的发育已成为一个热点问题。到目前为止，人们运用生理、[2]生物化学和分子生物学等多种手段来研究维管系统的发育。生理学研究表明生长素对于[3]维管系统分化十分重要；生物化学和减数杂交方法的研究也表明大量的蛋白质参与了管[4]状分子的形成，例如次生壁的形成和细胞程序性死亡过程；分子生物学的研究进一步证[5]明了某些基因在维管组织分化中的作用。目前拟南芥和菜豆已成为研究维管系统发育的[6,7]模式植物，尤其对拟南芥突变体的研究已为人们了解不同部位维管系统发育的分子机制[8,9][10,11,12,13

4、]开拓了道路，例如控制维管束的排列、真叶叶脉网络的形成、原形成层细胞的[14,15][16,17][18,19,]分化、初生木质部和次生木质部的分化以及叶和茎中维管组织的结构等。然本课题得到教育部博士点基金（项目编号：20020019034）资助http://www.paper.edu.cn而到目前为止，对野生型拟南芥种子至幼苗发育早期初生维管系统中导管分子发育的时空性研究，至今尚未见详细报道。本研究以野生型拟南芥为材料，首次应用共聚焦激光扫描显微镜对其整体透明材料观察，追踪种子萌发至幼苗发育过程中，导管分子在轴向和侧

5、向器官发生的位点、分化过程以及连接方式，以此揭示拟南芥初生维管系统中导管分子发育的时空性；能为生长素引起导管分子的分化提供佐证；同时也可为拟南芥突变体的维管系统发育及相关生理生化和分子生物学研究提供参考。2.实验材料及方法2.1种子及幼苗培养选取Columbia生态型野生型拟南芥（Arabidopsisthaliana）种子用0.5%高锰酸钾消毒5分钟，蒸馏水冲洗三遍后，置于1%琼脂培养基上，在HPG-400H人工气候培养箱中培养。培养箱中的光期温度为23℃，暗期温度为17℃；光照周期为16/8h。种子萌发5天后转移到

6、培养土（蛭石：方解土为1：1）中，在室温24℃进行幼苗培养。2.2应用共聚焦激光扫描显微镜观察整体透明材料取种子萌发后1h、2h、3h、4h、5h、6h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、28h和5d、6d，7d的材料，在7%NaOH溶液中浸泡24h（其中裹有种皮的材料先要去除种皮），蒸馏水冲洗三遍后,再用50%乙醇冲洗三遍,放入10%甘油中，在50℃温箱中挥发至100%甘油。材料用甘油封片。上述材料(每一时间点取2-3个样本)在整体透明前用体视显微镜观察；整体透明后材料不经染色，用ZEI

7、SSLSMMETA-5共聚焦激光扫描显微镜观察并拍照，其中激发光是488nm,每张图片有二十五张光切片，光切片厚度为0.9µｍ。以上实验重复2次。2.3石蜡切片取拟南芥种子萌发后5d的材料（每次取5个样本，重复2次），用50%FAA溶液固定，经乙醇系列脱水和二甲苯透明，浸蜡并包埋，用旋转切片机做纵切连续切片，切片厚度为8µｍ，经番红固绿对染后制成永久切片，在Olympus光学显微镜下观察并拍照。http://www.paper.edu.cn3.结果3.1拟南芥种子萌发后1-6h观察拟南芥种子萌发后1-6h，在体视显微镜

8、下观察：胚为曲生胚，子叶包于种皮内。初期子叶弯曲并与胚根成一定角度，后期由于子叶叶柄的伸长，使子叶与胚根所呈的弯曲度逐渐变小。经整体透明处理材料在共聚焦激光扫描显微镜下观察：种子萌发后1h，未见导管分子的分化，此时子叶的原形成层已经形成，由于原形成层细胞处于待分化状态，细胞质较浓厚，细胞壁未有木质素沉积，因此原形成层细胞未见自发荧