酶的提取和分离纯化

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1、11酶的提取与分离纯化暨南大学食品科学与工程系包惠燕tbhy@jnu.edu.cn食品酶学-包惠燕-11思考题1.酶提取纯化过程中应注意些什么？2.酶提取前进行的预处理包括什么？3.酶提取过程中为什么要破细胞？破细胞的方法有哪些？其中哪些可用于大规模生产？4.酶的抽提剂中常见成分的作用？5.酶和其它蛋白质的分离常依据哪些性质差异？分别有哪些主要的分离方法？6.SDS-PAGE指什么？试述其原理和应用。7.试述亲和色谱原理，画出示意图。本章主要内容酶的提取、纯化的基本原则细胞破碎酶的抽提浓缩与初步提纯酶的分离纯化方法酶的纯化步

2、骤酶纯化步骤的定量评价酶的提纯标准及剂型11.酶的提取、分离纯化酶的提取、分离纯化是将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开，而获得与使用目的、要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程酶的提取包括以下内容：材料的选择及前处理破细胞抽提浓缩与初步提纯11.1酶的提取、纯化的基本原则一、防止变性失效二、可以采用比一般蛋白质分离更多更有效的方法和条件三、提取、纯化的每一步都应进行酶活力的检测采用的方法应兼顾酶的回收和提高酶产品的比活力注意点1.除了少数例外，所有操作都应在低温下条件下进行，尤其在有有机溶剂存在时更应特别小心2.大多数酶在

3、pH<4或pH>10的情况下不稳定，故必须控制整个系统不要过酸或过碱；同时要避免在调节pH时产生局部酸碱过量的现象。3.酶和其它蛋白质一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作中应尽量减少泡沫形成。4.重金属、有机溶剂等能使酶变性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏，所有这些也都应予以足够的重视。酶分离纯化的工艺流程设计设计时需要考虑的因素：酶源材料前期工艺过程产品对纯度的要求酶存在的状态设备条件动力、原料成本及工时费用酶分离纯化的工艺流程设计合理的工艺应以降低成本，提高效能，同时又提高产品纯度和质量为前

4、提。对一个方法好坏的评价标准是：1.酶的回收率2.酶产品的比活力材料选择及其前处理动物材料：事先剔除结缔组织、脂肪组织植物材料：果实种子事先去皮壳，油质种子用乙醚等脱脂微生物发酵物：先将菌体和发酵物分离胞外酶酶胞内酶结酶溶酶11.2细胞破碎除了动植物体液中的酶和微生物胞外酶之外，大多数酶都存在于细胞内，因此提取和分离纯化前须将进行细胞的破碎。破碎细胞的方法有:机械法，物理法，化学法和酶法11.2.1机械破碎法指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：1.机械捣碎法利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将

5、组织细胞破碎。10000r/min此法在实验室和生产规模均可采用。2.研磨法利用研钵、石磨、球磨(不锈钢或玻璃珠直径0.2-1.0mm)、细菌磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎，必要时可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂。此法效率较低机械破碎法3.匀浆法利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成，也可由硬质塑料可不锈钢等制成。通常用来破碎那些易于分散，比较柔软，颗粒细小的组织细胞。此法细胞破碎程度较高，对酶的破坏也较少，但难于在工业生产上应用。11.2.2物理破碎法通过温度、压力、声波

6、等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎法。此法多用于微生物细胞的破碎1.温度差破碎法通过温度的突然变化使细胞破碎。例如将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。此法对较脆弱的细胞效果较好。但难以应用于工业化生产。2.压力差破碎法通过压力的变化使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压和渗透压差法等。（1）高压冲击法是在结实的容器中装入菌体细胞和冰晶、石英砂等混合物，用活塞或冲击锤加高压冲击之，使细胞破碎。冲击压力可达每平方厘米几百至几千kg。Manton-Gaulinho

7、mogeniservalve压力差破碎法（2）突然降压法是将菌体装进高压容器中，加压至30MPa以上，打开出口阀，使菌体悬浮液经阀门流出，出口处压力突然降为常压，由于膨胀而使细胞破碎。突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降，使细胞破碎。压力差破碎法（3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖溶液中平衡一段时间，然后离心收集细胞，迅速

8、投入4℃左右的蒸馏水或低渗溶液中。由于细胞外渗透压突然降低，而使细胞破碎，将细胞中的酶等物质释出胞外。此法适用于膜结合的酶、细胞间质酶等的提取。可用于从海洋微生物中提取某些酶。但对G+菌不适用。3.超声波破碎法利用超声波的机械振动而使细胞膜上所受张力不均而破碎。Fig.Sonicator1