酶的提取与分离纯化

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1、酶的提取与分离纯化（制作人：王众黄文辉王晨）要点１：细胞破碎２：提取３：沉淀分离４：离心分离５：过滤与膜分离６：层析分离７：电泳分离８：萃取分离９：结晶10：浓缩与干燥1细胞破碎细胞破碎是通过各种过程使细胞外层结构破坏的技术过程。细胞破碎的方法机械破碎法物理破碎法化学破碎法酶促破碎法机械破碎法1捣碎法定义利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎的方法。使用范围动物内脏植物叶芽细菌2研磨法利用研钵，石磨，细菌磨，球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎的方法。必要时加入石英砂等助磨剂。使用范围植物和微生物

2、组织细胞的破碎3匀浆法利用匀浆器产生的剪切力将组织细胞破碎的方法。使用范围易于分散，颗粒较小，比较柔软的组织细胞也可以对捣碎法和研磨法产生的颗粒进行进一步研磨物理破碎法定义：通过温度，压力，声波等物理因素的作用是组织细胞破碎的方法。多用于微生物细胞的破碎1温度差破碎法利用温度的突然变化﹑热胀冷缩的作用使细胞破碎的方法称为温度差破碎法用于脆弱，易于破碎的细胞的革兰氏阴性菌，酶提取时温度不能过高，难于用于工业生产2压力差破变化碎法利用压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力破碎法。常用的有高压冲击法，突然降压法及渗透压变

3、化法渗透压变化法是渗透压突然变化引起的细胞破碎的方法，此法特别适用于膜结合蛋白酶﹑细胞间质酶等的提取，但对革兰氏阳性菌不适合，主要是细胞壁由肽聚糖组成，能承受渗透压的突然变化。3超声波破碎法利用超声波发生器所发生的声波或者超声波的作用，使细胞膜产生空穴（cavitation)而使细胞破碎的方法。简便，快捷，效果好，特别适合微生物细胞的破碎，对数生长期的细胞进行破碎化学破碎法定义：通过各种学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法。常用的化学试剂：甲苯，丙酮，丁醇，氯仿等有机溶剂表面活性剂：特里顿（Triton），吐温（T

4、ween)（非离子型）原理：有机溶剂使细胞膜的磷脂结构破坏，改变细胞膜的通透性，低温下进行。表面活性剂与磷脂及至蛋白相互作用，破坏细胞结构。表面活性剂有离子型和非离子型两种。离子型对细胞膜的破坏性效果较好，但会破坏酶的空间结构，故采用非离子型的。酶促破碎法定义：通过细胞自身的酶系或者外加酶制剂的催化作用，使细胞的外层结构遭到破坏，而达到细胞破碎的方法。自溶法：自身酶系，取决于温度，ＰＨ，离子强度。外加酶：革兰氏阳性菌　　溶菌酶破坏β－１,４糖苷键酵母菌β－葡聚糖酶水解β-1，3-葡聚糖霉菌　　几丁质酶植物细胞　　纤维

5、素酶，半纤维素酶和果胶酶２提取定义：在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液的过程，也成为酶的提取。酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液0.02~0.5mol的盐溶液用于提取在的低浓度盐溶液中溶解度大的酶酸溶液PH2~6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大且稳定性较好的酶碱溶液PH8~12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂可能与水互溶的有机溶剂用于那些与脂质结合牢固或含有较多非极性集团的酶提取方法1盐溶液提取：大多数蛋白酶都溶于水(P酶），而

6、且在低浓度盐溶液条件下，酶的溶解度随着盐浓度的升高而增大的现象称为盐溶。当盐浓度达到一定的界限后，酶的溶解度随着浓度的提高而降低的现象称为盐析。核酸类酶（R酶）的提取，一般在细胞破碎后，用0.14mol/L的氯化钠溶液提取，得到核糖核蛋白提取液，在进一步与蛋白质等杂质分离酶ＲＮＡ２酸溶液的提取：有些酶在酸性溶液的溶解度大，且稳定性好，宜用酸溶液提取，ＰＨ不能太低，以免使酶失活。胰蛋白酶可用（０．１２ｍｏｌ／Ｌ）的硫酸溶液提取３　碱溶液提取：适用于在碱溶液溶解度大且稳定性好的酶　，例如Ｌ－天冬氨酸酰胺酶在　ＰＨ１１~１

7、２的碱液提取。注意加碱液时要一边搅拌一边搅拌加入，以免局部过碱，造成酶失活。４有机溶剂提取与脂质牢固结合且含有较多非极性集团的酶，可采用与水混溶的乙醇，丙酮，丁酮等有机溶剂提取，例如琥珀酸脱氢酶，胆碱脂酶，细胞色素氧化酶采用丁醇提取。影响提取的主要因素１温度温度对酶的提取效果影响明显，适当提高温度，可以增加酶的溶解度和分子扩散速度，但温度过高会引起酶的变性失活。采用有机溶剂时，温度控制在０~１０℃低温条件下。室温下提取的有酵母醇脱氢酶，细菌碱性磷酸酶，胃蛋白酶。２ＰＨ溶液的ＰＨ对酶的溶解度和稳定性有显著影响，不同的Ｐ

8、Ｈ酶会带不同的电荷及其带的电荷量不同，酶在等电点的溶解度最低，故提高溶解度应该避开等电点，但不能过高过低。３提取液的体积增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。过量的提取液会使酶浓度降低，对分离纯化不利。所以提取液总量一般为原料体积的３~５体积，最好分几次提取。在酶的提取过程中，体积小，颗粒的比表面积大，扩散面积大，有利于提高扩散速度，适当的搅拌