酶的提取与分离纯化

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1、第三章酶的提取与分离纯化★酶的提取基本概况★离心法酶的分离纯化2、沉淀分离（根据溶解度的不同）提取特点:使溶液中的溶质由液相转变为固相析出古老、实用、简单的初步分离方法生物大分子制备中常用沉淀方法：1中性盐沉淀（盐析法）2有机溶剂沉淀3选择性沉淀（热变性和酸碱变性）4等电点沉淀5有机聚合物沉淀★2.1盐析沉淀法（改变离子强度）①基本原理（盐溶和盐析）:向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：●盐溶（saltingin）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。●盐析（saltingout）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。★蛋白质的盐析离子强度硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影

2、响盐析盐溶★原因：高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。★蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域★★②盐析用盐●常用（NH4）2SO4，其突出优点：a.溶解度大b.分离效果好c.不易引起变性d.价格便宜★③盐浓度的表示用饱和（溶解）度表示:溶液中饱和硫酸铵的体积饱和度＝溶液的总体积★④调整盐浓度的方式⑴饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液.所需添加饱和硫酸铵溶液的体积：S2-

3、S1V=V0————1-S2V,V0:分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积S2,S1:需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度★⑵添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。按下式计算，得表中数据B(S2-S1)W=——————1-AS2A,B——常数，与温度有关。实际使用时，可直接查表（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。★调整硫酸铵溶液饱和度计算表★盐析操作低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过40％。高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。注意:固体硫酸铵要研细，温和搅拌中缓慢加入。冰箱中（4℃）过夜，待

4、沉淀完全后高速离心。沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration）、透析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。★⑶盐析曲线的制作如要分离一种新的蛋白质或酶，应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。蛋白质量(mg)或酶活力硫铵饱和度％102030405060708090100★硫酸铵浓度（%）枯草杆菌-淀粉酶发酵液的盐析曲线★⑷盐析的影响因素●离子强度和种类（介绍盐析常数）蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：I：离子强度，I=∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）；Z：离子价数S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L）S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度

5、（g/L）Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。Ks代表盐析效率，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。★当温度一定时，S0对于某一溶质是常数，用β表示，盐析方程式可改写为：logS=β-KsI两种盐析法：Ks分级盐析法：在一定的pH和温度条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。β分级盐析法：在一定离子强度下，通过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。●蛋白质浓度：稀回收沉淀难，浓易共沉淀，2.5%-3%最好。●pH值：等电点处最易沉淀。●温度的影响：稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。浓盐溶液

6、中，温度升高蛋白质溶解度下降。一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。★2.2有机溶剂沉淀（降低介电常数）利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。①沉淀机理降低溶液的介电常数部分地引起蛋白质脱水②常用有机溶剂丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。★③优缺点：优点：分辨率比盐析法高沉淀不需脱盐溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：容易引起蛋白质变性失活有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。★④影响有机溶剂沉淀的因素温度：低温（0℃）操作。pH值：尽可能靠近其等电点。离子强度：采用<0.05mol/L的稀盐溶液,增加蛋白质在有机溶剂

7、中的溶解度,目的防止蛋白质变性蛋白质浓度：适当，一般为5〜20mg/ml★2.3等电点沉淀(isoelectricprecipitation)①原理蛋白质在等电点时溶解度最低不同的蛋白质具有不同的等电点②使用方法单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。★③优点：大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内;无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低;无需除掉多余酸即可进行下一步纯化.④缺点酸化