《RNA提取常见问题》PPT课件

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1、RNA提取的通用方法异硫氰酸胍/苯酚法原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。异硫氰酸胍/苯酚法步骤:材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70％乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞

2、裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。RNA提取的通用方法影响RNA提取的因素材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，－70℃短期保存影响RNA提取的因素样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样

3、品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。影响RNA提取的因素RNA提取常见问题RNA的降解OD260/OD280比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳RNA降解新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA

4、的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。RNA降解冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。OD260/OD280比值偏低蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决

5、办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260/OD280比值偏低抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.10-0.50之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD时，对照及样品稀释液请使用10mMTris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。电泳带型异常非变性电泳：上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S和18S条带分不开。变性电泳条带变淡：EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，

6、变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。下游实验效果不佳RNA降解抽提试剂的残留75%乙醇洗涤样品中杂质的残留多糖等杂质，再次沉淀DNA污染使用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNART常见问题分析和解决方案问题一：少量或没有RT-PCR产物RNA降解分离无污染，高质量的RNA；防止RNA降解RNA中含逆转录酶抑制剂70％（v/v）乙醇清洗RNA沉淀，除去抑制剂起始RNA量太低增加RNA的量多糖同RNA共沉淀用氯化锂沉淀RNA以除去多糖合成cDNA第一链合成的引物退火失败确定退火温度适合所用的引物RNA模板存在较多二级结构将RN

7、A和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火，提高逆转录反应温度反转录成功，PCR失败PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物可能原因解决方案RT常见问题分析和解决方案问题二：有非特异性带引物和模板的非特异性退火基因特异性引物设计较差RNA中有基因组DNA的污染形成引物二聚体镁离子浓度太高提高反应的温度和特异性提高引物的特异性使用扩增级DNaseⅠ处理RNA设计在3'端没有互补序列的引物优化镁离子浓度可能原因解决方案RT常见问题分析和解决方案问题三：产生弥散（smear）条带第一链产物的含量过高PCR反应中引物过多循环数过多退火温度过低寡核苷酸片

8、段产生的非特异性扩增常规PCR步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量减少PCR的循环次数提高退火温度提取高质量RNA，防止被DNA污染可能原因解决方案