动物基因组DNA、总RNA测定

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1、动物基因组DNA、总RNA的提取及含量测定吕绍武2009-10-15目的要求学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术；了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点；学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法。理论基础核酸是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，它和蛋白质是构成生物体的主要成分；按化学组成可以将核酸分成两大类：①含脱氧核糖核酸（DNA），主要存在于细胞核中；②含核糖核酸（RNA），主要存在于细胞质内；在生物体中核酸以结合成核蛋白的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解。核酸分离、纯化原则①保持核酸分子一级结构的完整性意义：

2、遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。②排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染；③无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应去除RNA分子）。注意：在低温下进行操作；减少物理因素对核酸的机械剪切力；防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pH值范围（pH值5-9），并要保持一定离子强度；防止核酸的生物降解；细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃

3、冰箱中。1、RNA的提取与测定RNA广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组织中。常见方法（依据RNA的种类和来源）：①苯酚法（实验室最常用的方法）②去污剂法、③盐酸胍法，苯酚法：组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水相加冷乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。优点：较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA。工业提取RNA的方法酵母细胞富含RNA，是工业上提取RNA的主要原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的浓盐法或稀碱法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺较

4、简单。浓盐法：使用10％氯化钠的溶液，同时在90摄氏度热提取3-4小时，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。经冷却，离心后上清液由乙醇沉淀RNA。稀碱法：使用0.2％氢氧化钠裂解酵母，然后用酸中和，除去蛋白和菌体，上清液由乙醇沉淀RNA，或调等电点PI2.5沉淀。工业提取RNA的方法原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。方法：先用组织捣碎机将动物肝脏制成组织匀浆，再用0.14mol/L氯

5、化钠溶液把细胞中的RNP提取出来，最后用酚将RNA和蛋白质分开。本实验提取RNA的原理及方法RNA提取匀浆：称取3克牛肝剪碎，加20mL0.14mol/L氯化钠溶液10000r/min左右匀浆1分钟左右；离心：匀浆后溶液离心8000r/min离心7分钟，量取上清液毫升数，沉淀物留做提取DNA；除杂质：于上清液中加入等体积80％苯酚溶液，搅拌充分混合10-15分钟，置冰箱冷却静止10-15分钟，离心取含有RNA上层水相，弃下层酚相；沉淀RNA：取上层水相含RNA溶液，加入2倍体积95％冷乙醇，搅拌，充分混合，置冰箱中冷却(约10-15分钟)，至出现白色絮状物—RNA，离心8000r/

6、min离心7分钟，取沉淀物；溶解：用少量去离子水（约20毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量。RNA含量测定方法测定RNA含量的方法：紫外吸收法、定磷法、地衣酚；本实验用地衣酚测定原理：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后者与3.5-二羟基甲苯（地衣酚）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰，RNA浓度在10~100μg/mL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。将样品配制成含5~50μg/mL核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm吸收值，计算核酸浓度：RNA浓度（μg/mL）=式中：O.D260为260nm波长

7、处吸收值；L为比色杯的厚度；0.024为每毫升溶液内含1微克RNA的光吸收值；×稀释倍数紫外吸收法在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物―钼蓝。H3PO4+12H2MoO4→H3P(Mo3O10)4+12H2O↓还原剂钼蓝钼蓝最大的光吸收在650-660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为1-10微克磷。定磷法RNA含量测定取8支试管，6支试管按上表所添加各种试剂绘制标准曲