动物基因组DNA及RNA制备

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1、动物基因组DNA/RNA提取及含量测定指导教师:谢承志目的要求学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法实验原理核酸和蛋白质是构成生物有机体的主要成分；核酸是生命的最基本物质。核酸按其化学组成可以分成两大类，一类含D-2-脱氧核糖的称为脱氧核糖核酸（DNA），主要存在于细胞核中；另一类含D-核糖的称为核糖核酸（RNA),主要存在于细胞质内；在生物体中它们结合成核蛋白的形式存在。由于核酸极不稳定，在较剧烈的

2、化学，物理因素和酶的作用下很易降解，因此在制备时应防止过酸、过碱及其它引起核酸降解的因素作用。在提取中为防止组织中广泛存在的核酸酶降解的作用，应在低温下进行，必要时加入抑制剂，如柠檬酸盐、氟化钠、砷酸盐等，皂土也可抑制DNA酶的活性，如果采用（SDS)或苯酚作蛋白质变性剂来分离核酸，它们同时也可以使核酸降解酶破坏，因此常获得较好的效果一RNA的提取与测定由于RNA的种类来源很多，因而提取制备方法各异，一般有苯酚法，去污剂法和盐酸胍法，其中苯酚法实验室最常用。组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层

3、被酚饱和的水相中，向水相加冷乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA工业上常用稀碱和浓盐法提RNA，用这两种方法提取的核酸均为变性RNA。主要用于制备核苷酸的原料，其工艺较简单。浓盐法:使用10％氯化钠的溶液，在90摄氏度提取3—4小时，经冷却，离心后上清液由乙醇沉淀RNA。稀碱法:使用0.2％氢氧化钠裂解酵母，然后用酸中和，除蛋白和菌体，上清液由乙醇沉淀RNA,或调核酸等电点PI2.5沉淀。工业提取RNA广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组

4、织中。本实验用动物肝脏经组织捣碎，制成组织匀浆，用0.14mol/L氯化钠溶液提取。把细胞之中的核糖核蛋白提取出来，留下含有DNA的细胞核物质，用酚将RNA和蛋白质分开。因为在0.14mol/L氯化钠溶液中，RNA－蛋白(RNP)溶解度大；而DNA－蛋白(DNP)溶解度低，其在1mol/L氯化钠溶液中溶解度最大。RNA含量测定RNA含量的测定方法很多：紫外吸收法、定磷法、地衣酚本实验用地衣酚测定，其原理是：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后者与3.5－二羟基甲苯（地衣酚

5、）反应，在铁或铜离子催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰，RNA浓度在10-100μg/ml范围内，光吸收与RNA浓度成正比，地衣酚特异性差，凡戊糖均有些反应。试剂和器材材料：动物肝脏试剂：0.14mol/L氯化钠标准RNA溶液：100μg/ml地衣酚试剂(现用现配)80％苯酚溶液95％乙醇器材：匀浆器、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等RNA提取匀浆：称取3克牛肝剪碎，加20ml0.14mol/L氯化钠溶液10000r/min左右匀浆1分钟左右离心：匀浆后溶液离心8000r/mi

6、n离心7分钟，量取上清液毫升数，沉淀物留做提取DNA用除杂质：加等体积80％酚溶液于上清液中，搅拌充分混合10－20分钟，置冰箱冷却静止30-40分钟，离心取上层水相含有RNA，弃下层酚相含蛋白质和DNA等杂质沉淀RNA:取上层水相含RNA溶液，加入2倍体积95％冷乙醇，搅拌，充分混合，置冰箱中冷却，至出现白色絮状物－RNA，离心8000rn/min离心7分钟，取沉淀物溶解：用少量去离子水（约4毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量RNA含量测定取8支试管,6支试管按上表所添加各种试剂绘制标准曲线。另2管

7、各加入0.4ml、0.6ml待测液，再加1.6ml和1.4ml水和2.0ml地衣酚试剂，加毕，摇匀，8支试管统一沸水加热25分钟，取出后冷水冷却，测定各管OD670为纵坐标，RNA浓度为横坐标作图，并计算提出的RNA的量和收率。(控制RNA浓度在10-100μg/ml之内）思考题RNA提取方法有几种？有什么优缺点？RNA提取过程中应注意什么？DNA的提取及含量测定DNA提取小牛胸腺，鱼类精子和植物种子的胚等含有丰富的DNA，动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白可溶于水或浓盐溶液，如1mol/l氯化钠，但在

8、0.14mol/l氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白则在0.14mol/l氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开，分离得到DNA－蛋白。本实验：将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS)溶液，使其DNA与蛋白质分离开来，蛋白变性，冷却，离心除蛋白，加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/l，则DNA溶解，加氯仿去除蛋白质，也可进一步重复操作得较纯DNA，最后用95%乙醇沉淀DNA。经常采用三种方法去除蛋白变性剂法:用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以