RNAi及其在抗HIV中的初步应用

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1、RNAi及其在抗HIV中的初步应用引言化学合成药物基因干预治疗反义核酸技术是设计一类有效抑制目的基因表达的人工反义RNA或DNA，来阻断某些基因的复制、转录和翻译，以阻断细胞内异常信号的传导。RNAi的发现转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)在对牵牛花进行研究时发现，将色素合成基因置于一个强启动子后，导入牵牛花中，试图加深花朵的紫颜色，结果是不仅转入的基因未表达，而且自身色素合成也减弱了.当时将这种现象称为转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilenci

2、ng，PTGS)或“共抑制”(co-suppression).起初，认为PTGS这是少数几种植物中的特殊现象。转基因导致的基因沉默PTGS广泛存在于植物、真菌、动物中.转基因沉默并非偶然现象，而是普遍存在的一种基因调控机制.郭苏（美国康乃尔大学Cornell复旦留美学生）1995年，用反义RNA阻遏华丽新小杆线虫(caenorhabditiselegans)par-1基因的表达以探讨该基因的功能。结果反义RNA确能阻断par-1基因的表达。但奇怪的是，注入正义链RNA作为对照，同样也阻断了该基因的表达GuoS,KemphuesKJ.par

3、-1,agenerequiredforestablishingpolarityinC.Elegansembryos,encodesaputativeSer/Thrkinasethatisasymmetricallydistributed.Cell1995;81:611-620AndyFire〔美国卡内矶研究所Carnegie）1998年首次将正义链和负义链的双链RNA(dsRNA)注入线虫，结果表现出比单独注射正义链或负义链都强得多的基因沉默.实际上每个细胞只需少数几个dsRNA分子就能完全阻断同源基因的表达.注入双链RNA不仅可以高效阻

4、断整个线虫的同源基因表达，还会导致其下一代同源基因的沉默，Fire将这种现象称为RNAi.FireA,XuS,MontgomeryMK,KostasSA,DriverSE,MelloCC.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature1998;391:806-811RNAi代表了一种的PTGS通路RNAi现象已经在很多生物体中被发现比如植物、真菌、果蝇及包括小鼠在内的脊椎动物.目前，认为是生物界广泛存在的转录后调控

5、的形式。针对基因功能研究中的敲除技术，科学家将RNAi称为对靶基因的“knockdown”，这是一个在后基因组研究中可与“knockout”相媲美的技术.2001年，RNAi技术被成功地引入到哺乳动物细胞基因功能的研究中，RNAiandSiRNARNAi：(RNAinterference)RNA干扰SiRNA：(smallinterferingRNAs）小分子干扰RNA片段将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默（PTGS)被称

6、为RNA干扰（RNAi）RNAi的作用机制RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititationandeffectorsteps)。在起始阶段:加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段SiRNAs。一个称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段:siRNA双链结合一个核酶复合物

7、从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。processingthedsRNAinto21-23ntfragments3427212016short-interferingRNAstepone:Dicercontains

8、twoRNAseIIIdomainssiRNAslongdsRNAsiRNAshaveadefinedstructure19ntduplex2nt3’overhangstheantisense