《Western印迹》PPT课件

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1、Western印迹实验目的实验原理Western印迹杂交法是利用特异性抗体做探针，对附着于固相支持体上的某些特异性蛋白进行鉴别和定量的方法。它具有固相操作简便及不必对细胞进行放射性预标记等优点。原理为：将待测样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白变性并分离，用电转移方法转移到固相支持体上（NC膜、PVDF膜），滤膜与抗靶蛋白的非标记抗体反应，再用二级免疫学试剂进行检测。检测方法有放射性标记、酶标化学显色或酶标化学发光等。酶标化学发光法以其高敏感性、结果可在X光片上长期保存等优点而优于酶标化学显色法。是蛋白水平检测，研究基因表达与功

2、能的一种方法。原理及步骤Torcell提取蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白（SDS-PAGE)转移（印迹）于硝酸纤维素膜加抗体检测某种特异性蛋白质WesternBlotWesternblot生物素HRP化学显色复合物ABC复合物组织抗原抗生物素一抗生物素化二抗抗HRP实验材料1．29:1聚丙烯酰胺凝胶2．Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mMTris碱250mM甘氨酸0.1%(m/v)SDS3．1×SDS凝胶加样缓冲液：50mmol/LTris-Cl(pH6.8)100mmol/L二硫苏糖醇（DTT）2%(m/v)SDS0.1%(m/v)溴酚蓝10%甘油临用前加

3、DTT，DTT可用0.01M乙酸钠（pH5.2）配成1mmol/L母液。4．转移缓冲液：25mMTris碱193mM甘氨酸20%甲醇5．1×TBS：20mMTris-HCl150mMNaCl最后调pH值至7.46．TBST:TBS中加入0.05%Tween-20。7．封闭液：用TBST配制5%脱脂奶粉。8．StrippingBuffer：100mMβ巯基乙醇2%(m/v)SDS62.5mMTris-HCl最后调pH值至6.7方法和步骤一．配胶注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。分离胶及浓缩胶均可事先配好（除

4、AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100,分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度。灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1

5、%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。二．样品处理

6、1．培养的细胞（定性）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loadingbuffer。⑶100℃，1min。⑷用细胞刮刀刮下细胞后在EP管中煮沸10min。⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在4000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。⑹待样品恢复到室温后上样。2．培养的细胞（定量）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3

7、遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。⑶用细胞刮刀刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。⑷12000g离心，4℃，2min。⑸取少量上清进行定量。⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。3．组织：⑴匀浆：对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意

8、尽量保持低温，快速匀浆。⑵12000g