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1、蛋白质的Western印迹分析一、实验注意事项：1、本实验所有操作避免用手直接接触PVDF膜，同时避免折划PVDF膜；2、实验过程中，要一直保持PVDF膜的湿润状态；二、实验流程1．蛋白质电泳：操作流程及注意事项参见《蛋白质的SDS－PAGE凝胶电泳》；2．SDS－PAGE凝胶转膜：1)将蛋白胶放于玻璃板上，测量大小，剪取相同大小的PVDF膜，做好标记，将膜放于100％甲醇内浸润超过10秒；2)剪取相同大小的六块滤纸，三张一份，与胶和PVDF膜放于转膜缓冲液内平衡超过10分钟；3)在转膜缓冲液中将三张一份的滤纸放于最底层，依次放上蛋白胶、PVDF膜、另外三张滤纸，对
2、齐后一手捏紧一角，另一手挤压滤纸，除去所有气泡，调整角度，重新挤压气泡；4)将转膜槽放于冰盒内，灌注转膜buffer，将中间固定好蛋白胶和PVDF膜的双层滤纸放于海绵夹层中，置于转膜模具内，之后将PVDF膜朝向正极放入转膜槽内中，根据目的蛋白大小选择合适电流和时间恒流转膜；3．蛋白质的免疫检测：1）取出PVDF膜放于平皿中，加入约25mlPBS-T，脱色摇床上摇动洗膜5分钟；2）在平皿内加入含5％脱脂奶粉的50mlPBS-T，脱色摇床摇动将膜封闭过夜；3）大体积（约30ml）PBS-T洗膜2×5分钟；4）将膜放于三面剪开的杂交袋中，热封两边后按每平方厘米0.1ml加
3、入稀释好的一抗，封闭最后一边，室温反应2小时；其中一抗稀释液为含0.25%BSA的PBS-T，一抗的稀释比例取决于所用抗体的效价和转到膜上目的蛋白的量，期间要至少每隔5分钟混匀一次杂交袋；5）剪开杂交袋，将膜放于平皿内加入20mlPBS-T洗3×10分钟，后用20mlTBS-T洗膜2×10分钟；7）依照一抗反应的方法，将膜放于新的杂交袋中，加入稀释好的二抗在杂交袋中反应1小时，二抗稀释液为含0.25%BSA的TBS-T；8）20mlTBS-T漂洗4×10分钟；9）将膜放于碱性磷酸酶反应buffer内摇动平衡2分钟10）在一小培养皿中依次加入7.5ml碱性磷酸酶反应B
4、uffer、33ulNBT、16.5ulBCIP混匀将膜放入，避光反应，并随时检测膜的颜色变化；11)目的条带出现后，大量自来水洗终止反应（或在50mlPBS-T内加入200ul0.5mol/LEDTA，用之终止效果更佳），照相保存；三、实验所需试剂：1．转移缓冲液1L：39mM甘氨酸：2.9g48mMTris：5.8g0.037%SDS：0.37g20%甲醇：200ml2．碱性磷酸酶缓冲液100ml：100mMNacl5mMMgcl2100mMTris-ClpH9.51、PBS-T1LpH7.5：1M磷酸二氢钠31.6ml1M磷酸氢二钠68.4mlTween200
5、.1%1ml水900ml，调pH后定容1L2、TBS-T1LpH7.6：Tris2.42gNacl8gTween201ml水900ml，调pH后定容1L；3、封闭液100ml：100mlTBS-T内加入5克脱脂奶粉4、一抗稀释液100ml：100mlPBS-T内加入0.25克BSA5、二抗稀释液100ml：100mlTBS-T内加入0.25克BSA预混合样品缓冲液组成缓冲液1x配方应用Laemmli样品缓冲液62.5mMTris-HCI,pH6.8,2%SDS,25%甘油,0.01%溴酚蓝SDS-PAGENative样品缓冲液62.5mMTris-HCI,pH6.8
6、,40%甘油,0.01%溴酚蓝NativePAGETricine样品缓冲液200mMTris-HCI,pH6.8,2%SDS,40%甘油,0.04%考马斯亮蓝G-250多肽和小蛋白SDS-PAGETBE-尿素样品缓冲液89mMTris-HCI,pH8.0,89mM硼酸,2mMEDTA,7尿素,12%Ficoll,0.01%溴酚蓝0.02%二甲苯青FF变性ssDNA,RNAIEF样品缓冲液50%甘油等电聚焦酶谱样品缓冲液62.5mMTris-HCI,pH6.8,25%甘油,4%SDS,0.01%溴酚蓝蛋白酶分析核酸样品缓冲液50mMTris-HCI,pH8.0,25%
7、甘油,5mMEDTA,0.2%溴酚蓝,0.2%二甲苯青FF非变性dsDNA,TBE凝胶LaemmliSDS-PAGESystemLowerGel: %TotalAcrylamide: 8%10%12%15%H2O(ml)12.110.58.756.254XLowerTrisBuffer(ml)6.256.256.256.2529:1Acrylamide:Bis(ml)6.678.351012.510%APS(l)130130130130TEMED(l)14141414 TotalVol: 25ml25ml25ml25ml UpperGel:
