实验细菌的生化鉴定

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1、常用细菌鉴定技术实验目的掌握细菌的基本鉴定技术细菌的基本鉴定技术生化反应鉴定：通过观察细菌利用酶和降解糖类、醇类、脂类、蛋白质和氨基酸的能力可以了解其生化活性，从而识别和鉴定细菌。免疫学鉴定（血清学鉴定）编码鉴定实验内容—生化反应鉴定（每2人一组）：1、糖（苷、醇）利用试验：乳糖分解利用试验2、氧化酶试验3、过氧化氢酶试验4、克氏双糖铁（KIA）5、半固体（M）（这个实验已做过，本次不做）6、吲哚试验（I）7、尿酶试验（U）一、糖（苷、醇）利用试验：乳糖分解利用试验【原理】不同的细菌对不同的糖（苷、醇）的分解能力不同，有的分解

2、，有的不能分解，有的分解后能产酸产气，有的分解后仅能产酸，因此可以用来鉴别细菌。以乳糖分解利用为例，乳糖发酵管中含溴甲酚紫指示剂，当细菌分解乳糖产酸，培养基pH下降，指示剂变黄色，不分解乳糖的指示剂不变色。乳糖分解利用试验菌种：大肠杆菌、变形杆菌培养基：乳糖发酵管方法：1、取2支乳糖发酵管，用记号笔分别标记大肠杆菌和变形杆菌。2、按细菌的液体接种法，将大肠杆菌和变形杆菌分别接种到乳糖发酵管中，放入培养箱中培养18~24h。乳糖分解利用试验结果观察乳糖发酵管中含溴甲酚紫指示剂，当pH值>6.8时呈紫色，pH值<5.2时呈黄色，当细

3、菌分解利用乳糖，产酸，使培养基的pH值变小，呈黄色。如细菌不能分解乳糖，则乳糖发酵管仍为紫色。接种大肠杆菌的乳糖发酵管变为黄色，接种变形杆菌的乳糖发酵管仍是紫色。说明大肠杆菌能够分解乳糖，变形杆菌不能分解乳糖。乳糖发酵管中如果有小导管，还可以观察产气情况。大肠杆菌能够分解利用乳糖，产酸，产气，小导管中有气泡产生。氧化酶试验【原理】氧化酶又称细胞色素氧化酶，能将还原型细胞色素C氧化形成水和氧化型细胞色素C，氧化型细胞色素C再使四甲基对苯二胺氧化，形成显色反应。氧化酶试验【试剂与器材】1．菌种大肠埃希菌、铜绿假单胞菌2．试剂氧化酶试

4、剂（1%四甲基对苯二胺）3．器材2cm×2cm滤纸片、污物缸氧化酶试验【操作步骤】1．将滤纸片叠成四方块状。2．用滤纸片的中心尖角小心刮取大肠埃希菌菌落，注意不可碰到培养基。3．轻轻展开滤纸片，刮取的菌落正好在滤纸片中心，滴加一滴1%四甲基对苯二胺。4．立刻观察菌落颜色的变化。5．同法做铜绿假单胞菌的氧化酶试验。氧化酶试验【结果】滴加氧化酶试剂后铜绿假单胞菌立刻变为紫色，为氧化酶阳性。大肠埃希菌不变色，为氧化酶阴性。氧化酶试验（左侧为铜绿假单胞菌、右侧为大肠埃希菌）氧化酶试验【注意事项】1．实验中的菌种要求新培养的，不宜用陈旧的

5、培养物。2．刮取细菌时不可碰到培养基，不可用接种环等金属物品取菌。3．氧化酶试剂要新鲜配制，一般装在棕色瓶中，放在冰箱中可保存一周，时间长了易被空气氧化变色。4．结果要立刻观察，1min内变色者为阳性，超过1min变色的为阴性。5．在滤纸片上滴加试剂时不要过多，以刚润湿纸片为宜，如滤纸片过湿，可能妨碍空气与细菌接触，延长反应时间，造成假阴性。过氧化氢酶试验【原理】过氧化氢酶试验又称触酶试验。部分细菌含有黄素蛋白，在代谢过程中与空气中的氧发生反应，形成过氧化氢，过氧化氢对细菌有毒害作用，会破坏细胞组分，因此，细菌为保护自己，通常具

6、有过氧化氢酶，可以催化裂解过氧化氢，形成水和氧气。过氧化氢酶试验【试剂与器材】1、菌种金黄色葡萄球菌2、试剂3%过氧化氢3、器材载玻片、无菌移液器吸头、酒精灯、火柴、超净工作台过氧化氢酶试验【操作步骤】1、在载玻片中央滴加一滴3%过氧化氢。2、用无菌移液器吸头蘸取少量细菌，在3%过氧化氢中混匀。【结果】观察气泡的产生情况。可以看见在吸头上金黄色葡萄球菌菌苔周围，产生大量气泡，为过氧化氢酶阳性。如果菌苔周围无气泡产生，为过氧化氢酶阴性。过氧化氢酶试验【注意事项】1、普通金属接种环可能与过氧化氢反应，形成气泡，造成假阳性，因此必须使

7、用铂丝接种环或塑料、玻璃材质的工具。2、从血液琼脂平板上挑取菌落时千万小心，不要碰到培养基，因红细胞中有过氧化氢酶，即使一点点也会造成假阳性。3、过氧化氢试剂现配现用。克氏双糖铁（KIA）原理：克氏双糖铁（KIA)主要用于革兰阴性杆菌的鉴别，分解乳糖的细菌斜面为黄色，分解葡萄糖的细菌底层为黄色，产生硫化氢的细菌培养基中出现黑色。此外还可以观察细菌分解葡萄糖是否产气。克氏双糖铁（KIA）【试剂与器材】1、菌种大肠埃希菌、变形杆菌2、器材克氏双糖铁（KIA）、接种针、酒精灯、火柴、记号笔、试管架、37℃恒温培养箱，超净工作台。【操作

8、步骤】1．取2支克氏双糖铁（KIA），用记号笔分别标记大肠埃希菌、变形杆菌。2．按细菌的斜面接种法，将大肠埃希菌、变形杆菌分别接种到相应的管中。3．放入培养箱中培养18~24h。克氏双糖铁（KIA）结果观察：观察上部和下部的颜色变化，变黄为产酸，变红为产碱，有气