抗人ILT4单克隆抗体制备及初步鉴定

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1、抗人ILT4单克隆抗体制备及初步鉴定作者：王春艳，李德敏，宋朝君，李娜，王东琳，金伯泉【摘要】目的：制备抗人ILT4分子单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法：应用淋巴细胞杂交瘤技术，制备小鼠源性抗人ILT4mAb。用间接ELISA法测定腹水mAb的效价。以Westernblot测定mAb的抗原结合活性。通过流式细胞术(FCM)对mAb结合转染细胞表面及天然细胞表面ILT4分子的活性进行鉴定。结果：获得7株分泌抗ILT4mAb的杂交瘤细胞株。ELISA法测定腹水mAb的效价均达1x10-6,7株mAb均为IgGl(

2、k)oWesternblot结果显示，3株mAb与人ILT4有良好的结合活性。用转染细胞及U937细胞做FCM分析发现另外4株mAb可结合真核表达的及天然的ILT4分子。结论：获得7株能特异性识别ILT4分子的mAb,为研究ILT4分子的组织分布和功能研究提供了可靠的实验手段。【关键词】ILT4淋巴细胞杂交瘤技术单克隆抗体免疫球蛋白样转录物4(immunoglobulinliketranscript,ILT4),又称白细胞免疫球蛋白样受体2(leukocyteimmunoglobulinlikereceptor,LI

3、R2）、CD85d及LILRB2是一种主要表达于髓样单核细胞表面的受体[l]oILT是一类在基因和分子结构上以及功能上同KIR相关的膜分子。ILT4表达于单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞等髓样细胞。ILT4可结合经典MHCI分子及非经典MHCI分子HLAG[2],抑制钙内流，胞质区募集SHP1蛋白酪氨酸磷酸酶，抑制受体内化，并抑制抗原进入内体进行加工。ILT4可能参与调控髓样单核细胞介导的细胞毒活性及炎症反应，并调节抗原提呈功能，防止自身免疫应答[3]。我们采用小鼠淋巴细胞杂交瘤技术,制备了小鼠抗人ILT4分子不同表位

4、的单克隆抗体(mAb),为进一步研究ILT4分子结构和功能的关系提供了重要的工具。1材料和方法1.1材料人ILT4重组蛋白由牛津大学分子医学研究所提供。RPMI1640干粉购自Hyclone公司。新生牛血清(FCS)购自杭州四季青生物工程材料研究所。HAT购自Gibco公司。PEGMW4000购自Merck公司。8周龄雌性BALB/c小鼠(二级)由本校实验动物中心提供。小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0从澳大利亚IMVS引进。福氏完全、不完全佐剂购自Sigma公司。检测小鼠Ig类和亚类的试剂盒购自Pierce公司。Weste

5、rnblot试剂盒购自Roche公司。PVDF膜购自Amresco公司。标准蛋白购自BioRad公司。FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体购自B&D公司。1.2方法1.2.1分泌抗人ILT4mAb的杂交瘤细胞株的建立用人ILT4抗原加福氏完全佐剂混合并充分乳化后，皮下多点注射于BALB/c小鼠，第2次加用福氏不完全佐剂，间隔4周。第3次腹腔免疫。每次免疫每只小鼠均用抗原20ngo融合前3d用同等剂量的抗原生理盐水溶液腹腔加强免疫1次。细胞融合、筛选、克隆化及腹水制备均按常规实验操作进行［4］。1.2.2mAb效价

6、及Ig亚类的鉴定将腹水按系列稀释后，采用间接ELISA法检测腹水中mAb的效价。用小鼠Ig类和亚类试剂盒鉴定每株杂交瘤细胞培养上清中mAb的Ig亚类。1.2.3Westernblot检测抗ILT4mAb的特性用Westernblot鉴定其与变性ILT4蛋白的反应性及相对分子质量（Mr）。取5yg人ILT4加入到2x上样缓冲液中，经120g/L的SDSPAGE后，转移至PVDF膜上，用50g/L脱脂奶粉（TBS）室温封闭1h。依次滴加以封闭液（1：1000）稀释的抗人ILT4腹水（室温孵育2h或4€过夜，洗膜3次）及1

7、:1000HRP标记的山羊抗小鼠IgG（室温孵育lh，洗膜3次），最后加发光底物（鲁米诺）显影。1.2.4FCM检测抗ILT4mAb结合转染细胞及天然细胞表面ILT4的特性用PBS调整转染细胞或U937细胞的密度为1x109/L,每管中加入1mL细胞悬液，再以上述条件离心。去上清，加入100ML100mL/L山羊血清室温封闭10min,分别加入腹水1yL（同型对照管中加入小鼠抗SEDmAb腹水），于4C孵育lh。洗3次后，离心，用100nLPBS重悬细胞，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG1uL,于4°C避光孵育lh

8、。洗3次后离心，用300mLPBS重悬细胞，以FCM检测。2结果2.1杂交瘤细胞株的建立和mAb的特性鉴定获7株可稳定分泌抗ILT4mAb的杂交瘤细胞，命名为FMUILT4NO.1〜NO.7。间接ELISA法测定腹水的效价均达1x10-6,其亚类均为IgGl（k）。2.2抗ILT4mAb与重组蛋白反应性的Westernblot检测7株mAb中,