抗人骨桥蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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1、抗人骨桥蛋白单克隆抗体的制备及鉴定：周群芳,鞠吉雨,郎景和【摘要】　　目的:制备抗人骨桥蛋白（hOPN）的单克隆抗体（mAb）,用于其功能研究。方法:构建OPN的原核表达载体pTriEx1hONP载体,转化Tuner(DE3)placI感受态大肠杆菌,用IPTG进行诱导表达。利用镍柱亲和层析纯化OPN蛋白,纯化蛋白经超滤浓缩洗涤后即为免疫原。以重组纯化的OPN蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得分泌鼠抗人OPN蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、_000582）设计一

2、对扩增引物扩增人OPN基因编码序列全长:PCR上游引物P1为5′CGGGAGCTCCCAGATGCTGTGGCCACATG3′,引入SacI酶切位点,下游引物P2为5′GTGCTCGAGATTGACCTCAGAAGATGCAC3′引入XhoI酶切位点。扩增部分为hOPNcDNA序列（AccessionNumber:NM_000582）的2741065位核苷酸。以pET28ahOPN为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃预变性3min,然后94℃45s,55℃45s,72℃1min循环,共30个循环,最后72℃延伸10min,PCR产物用凝胶回收试剂盒回收后和pTri

3、Ex1均以SacI和XhoI酶切并纯化,二者用T4DNA连接酶16℃连接过夜,转化大肠杆菌DH5α,将菌液涂布于含100mg/L氨卞青霉素的LB平板,筛选阳性克隆并进一步用PCR和测序进行鉴定。　　1.2.2OPN蛋白的诱导表达和纯化挑取鉴定正确的pTriEx1hONP质粒转化大肠杆菌Tuner（DE3）placI,挑取单个阳性克隆接种于含有5mLLB培养基（含氨苄青霉素100mg/L,10g/L的葡萄糖）中,37℃250r/min摇菌至A值达0.5左右时,加入浓度为1mmol/L的IPTG,诱导3h后离心收集菌体,同时在诱导前取样作为对照。收集的菌体经超声裂解后取上清和沉淀分别进

4、行SDSPAGE电泳,考马斯亮兰染色分析。按上述方法对pTriEx1hONP进行大量诱导表达蛋白,取出培养物5000r/min离心收集细胞,超声破碎细胞,镍离子金属鳌合柱（NiNTA）纯化目的蛋白,收集洗脱液,经SDSPAGE鉴定后超滤管超滤浓缩洗涤后备用。　　1.2.3鼠抗人OPNmAb的制备纯化后的OPN抗原与等体积的完全弗氏佐剂混合,充分搅拌直至成为油包水,腹部皮下多点注射。每只小鼠注射20μg抗原,共注射5只小鼠。2周后同剂量抗原加福氏不完全佐剂加强免疫,加强免疫2次。后一次加强免疫7d后以间接ELISA检测小鼠血清抗人OPN多抗的效价,效价高者尾静脉再冲击免疫1次,每

5、只20μg,3d后进行细胞融合。将免疫小鼠的脾细胞悬液与体外培养的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞以5∶1的比例在聚乙二醇作用下按常规法融合,采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化培养。以重组纯化的人OPN蛋白作为抗原（0.4mg/L）包被酶标96孔板,间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清,所测的A490比阴性对照高10倍的克隆,进行亚克隆化,并进行扩增冻存。经过3次有限稀释克隆化,将分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系大量扩增并冻存,长期传代培养后,以相同的方法再次克隆化鉴定之。　　1.2.4mAb生物学特性的分析和鉴定（1）mAb的Ig亚类鉴定:取杂交瘤细胞培养上清液,用Roch公司提供的IsoSt

6、ripTM鼠mAb亚类检测试剂盒进行IgG亚类鉴定。具体操作过程按照说明书进行。（2）应用_000582）相应序列相符,证实表达载体pTriEx1hOPN构建成功。　　2.2hOPN融合蛋白的诱导表达及纯化pTriEx1hOPN阳性菌株经IPTG诱导后SDSPAGE电泳显示:在37℃、1mmol/LIPTG诱导3h条件下,融合蛋白表达达到高峰,蛋白条带位于Mr约55000处（比计算的Mr大）。该重组蛋白主要以可溶性形式存在,用镍离子金属鳌合柱（NiNTA）层析柱纯化后,蛋白浓度证实纯度在85%以上(图3)。　　图3重组蛋白的SDSPAGE分析（略）　　M:蛋白质marker

7、;1,2:pTriEx1转化Tuner（DE3）placI诱导前的上清和沉淀;3,4:pTriEx1转化Tuner（DE3）placI诱导后的上清和沉淀;5,6:pTriEx1hOPN转化Tuner（DE3）placI诱导前的上清和沉淀;7,8:pTriEx1hOPN转化Tuner（DE3）placI诱导前的上清和沉淀;9:纯化的OPN蛋白.　　2.3特异性分泌鼠抗人OPNmAb的杂交瘤细胞株的建立按常规方法以重组人OP