cd133原核表达、纯化和初步鉴定

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1、中文摘要CDl33抗原的原核表达、纯化和初步鉴定研究生：朱小俊导师：嵇振岭1教授(1东南大学附属中大医院普外科，江苏南京210009)目的：制备CDl33特异性抗原用于筛选CDl33噬菌体单链抗体文库，使筛选产物能够与肿瘤干细胞表面的CDl33抗原结合以达到靶向治疗的目的。方法：用PCR扩增CDl33第二、三两段胞外区，分别将扩增的两段片段与pGEX4T．1(6*HIS)质粒连接，酶切鉴定后测序验证。将连接产物转入大肠杆菌BL21菌株中并诱导表达，挑取单克隆培养后再经酶切鉴定并测序验证。取构建成功的基因工程菌株于1000ml氨苄．LB培养液中生长

2、，O．4mMIPTG37℃诱导过夜表达后，超声裂解蛋白，取周质和包涵体蛋白分别进行12％的SDS．PAGE凝胶电泳，随后以考马斯亮蓝染色，选择表达目的蛋白的菌株进一步大量表达，镍柱纯化。间接ELISA法鉴定目的抗原的特异性。结果：(1)将CDl33分子二、三两段胞外区PCR扩增后琼脂凝胶电泳，在750bp处可见两条亮带与理论值符合相符，证明扩增成功；(2)第二、第三胞外区．pGEX4T．1目的基因双酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳显示在750bp处均可见插入的目的片段，序列检测表明插入片段无突变。IPTG诱导表达相应蛋白，经超声破碎，将上清和沉淀分别

3、进行12％的SDS．PAGE凝胶电泳，目的蛋白在沉淀中表达量较多，说明目的蛋白主要表达在包涵体中；(3)经间接ELISA初步鉴定表明纯化后的第二、三CDl33胞外片段蛋白与CDl33抗体有特异性的结合。东南大学硕士学位论文结论：成功构建CDl33胞外片段2及3的重组质粒，原核表达并纯化获得CDl33胞外结构域2蛋白及胞外结构域3蛋白，经ELISA鉴定可以与CDl33单克隆抗体特异性结合，可用于筛选CDl33噬菌体抗体库制备人源性抗CDl33单链抗体。【关键词】CDl33分子；重组质粒构建；原核表达；镍柱纯化；ELISAIII英文摘要Thqpres

4、sion，purificaticandidentificationofCD133lleexresslonDUrlllCationanenUllCatlon，antigensZHUxiaojunTutor：ProfessorJlzhenlin91(DepartmentofSurgery，SoutheastUniversityMedicalSchool，Nanjing，210009)Abstractobjeetive：MonoclonalantibodiescarlspeciallyrecognizethetumorsurfaceCDl33-anti

5、genhavebeenestablished．Thecriticalstepsofproducingaspecificmonoclonal-antibodyisdesignedusefulCD133antigens．Methods：HumanCDl33-antigenhasfivetransmembranedomainswithtwolargeextracellularloops．Thetwolargeextracellularsequences、)l船PCRamplified,clonedintoaPGEX4T-I(6+ms)vectortha

6、thadanN-terminalHis-tag，sequenceverifiedandthentransformedintoaBL-21(DE3)E．colistrain．Forproteinexpression,O．5LoftransformedbacteriaweregrowninLBmediumandwereinducedbY0．4mMIPTGfor2lLThecellswerepelletedbYcentrifugafion,resuspendedinTris-HCllysisbuffer,andweredisruptedbYsoniea

7、tiononanicebath．Proteinexpressioninsupematantandpelletwereanalyzedbyresolvingthemina12％SDS-PAGEgelandthenstainingbyeoomasieblue．RecombinantproteinWaSpurifiedfromthepelletbyuSillgnickel-NTAbeads．IdentificationofspecificitybyindirectELISA．Results：(1)PCRamplificationoftheextrace

8、UulardomainofCDl33antigenandenzymeappreciationofrecombinantplasmid，t