乙脑病毒E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定

《乙脑病毒E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、乙脑病毒E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定作者：高淑娴，张伟，任君萍，雷迎峰，丁天兵，宋建华，马文煜，徐志凯　　【Abstract】AIM:ToconstructgeneencodingJapaneseencephalitisvirus(JEV)envelopeglycoproteinandtoexpressEproteininBL21(DE3).METHODS:UsingRTPCR,thegeneencodingEproteinwasamplified.ThegenewasclonedintopET28a(+)andtherecombinantplasmi

2、dpET286HisEwastransformedintoBL21(DE3).The6HisEproteinexpressedinBL21(ED3)wasdeterminedbySDSPAGEandWesternBlotting.TheexpressionproductininclusionbodywaspurifiedbyNiNTAchromatography.RESULTS:SequencingofEgenerevealedthatthemutationratewas0.2﹪(3/1500)andthebasemutationdidntcha

3、ngetheaminoacidnonsense.TherecombinantexpressionvectorpET286HisEwasconstructedandthe6HisEproteinwassuccessfullyexpressedinaninsolubleform.Afterexpressionandpurificationbymetalchelateaffinitychromatography,purified6HisEfusionproteinwasobtained.CONCLUSION:TheEproteincanbeexpresse

4、dinprokaryoticcellandwouldbeusefulforfurtherresearchonthereceptorofJEV10anditsinfectionmechanisms.　　【Keywords】encephalitisvirus,Japanese;viralenvelopeproteins;recombinantfusionproteins　　【摘要】目的：构建乙脑病毒（JEV）E蛋白重组载体并在原核细胞BL21(DE3)中表达.方法：采用RTPCR扩增片段,定向克隆入pET28a(+)中；重组载体pET28a6HisE转化B

5、L21(DE3),通过酶切、SDSPAGE和WesternBlotting检测其载体构建和蛋白表达；表达产物包涵体经NiNTA亲和层析纯化.结果：构建得到原核融合重组载体pET28a6HisE；诱导后表达得到6HisE融合蛋白，纯化得到表达产物并进行了初步的鉴定.结论：表达并纯化得到JEVE蛋白原核表达产物.　　【关键词】脑炎病毒，日本；病毒包膜蛋白质类；重组融和蛋白质类　　0引言　　　　流行性乙型脑炎（Japaneseencephalitis,JE）简称乙脑，是由嗜神经的乙脑病毒（JEV）所致的中枢神经系统性传染病［1］.JEV属包膜病毒科黄病毒

6、属，呈球型，直径20～30nm，核心含单股RNA，有衣壳，有三个结构蛋白，即E蛋白、核蛋白C和膜蛋白M.E蛋白为糖蛋白，包裹在病毒的表面，它决定着病毒的毒力及其宿主范围，不仅在与宿主细胞受体结合及随后的膜融合中发挥重要作用，而且可刺激产生中和抗体［2］.10我们对E蛋白进行了原核表达、纯化及鉴定，为进一步研究病毒的受体和病毒的感染机制提供了有利条件.　　1材料和方法　　1.1材料pET28a(+)表达载体和XL10,BL21(DE3)宿主菌为本试验室保存.P1，P2引物合成及序列测定由三博远志生物技术有限责任公司完成；限制性内切酶、PMD18T，EXT

7、aq聚合酶和连接试剂盒（宝航公司）；逆转录试剂盒（Invitrogen公司）；JEV鼠源性mAb和兔源多克隆抗体由本实验室制备；猴抗鼠红外标记二抗、羊抗兔红外标记二抗（Rockland公司）；红外成像系统（LICOR公司）；高速低温离心机（BECKMAN公司）；恒温摇床（上海智城公司）.　　1.2方法　　1.2.1片段的扩增及表达载体的构建用Trizol提取JEVRNA，以8μLRNA为模板,1μLP1为引物,1μLdNTP65℃水浴5min,冰浴1min,2μL10×RT缓冲液,4μL25mmol/LMgCl2,1μLRNaseoutRecombinan

8、tInhibitor,42℃水浴2min；加1μLs