病毒E蛋白的原核表达纯化及初步鉴定

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鸭坦布苏病毒E蛋白基因的原核表达姬希文2,李雪松I,边延峰3,李国新I,颜丕熙I,张七斤彳，李泽君I(1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特010018；3•天津生机集团股份有限公司，天津300384)摘要：本研究利用RT-PCR方法扩增鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus,DTMUV)奉贤株(FX2010)的结构蛋白E基因，并将其克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组表达质粒pET32a-E。将其转化受体菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE和Westernblot试验检测结果表明，£基因在大肠杆菌中得到了表达，并且可与抗DTMUV的多克隆抗体发生特异性反应。E恳因的成功表达为DTMUV的诊斷试剂盒、疫苗等的研制奠定基础。关键词：鸭坦布苏病毒；E基因；克隆；表达中图分类号：文献标志码：A文章编号：1674-6422(2012)02-0000-00EXPRESSIONOFEPROTEINOFDUCKTEMBUSUVIRUSINPROKARYOTICCELLSJIXi-wen1'2,LIXue-song1,BIANYan-feng3,LIGuo-xin1,YANPi-xi1,ZHANGQi-jin2,LIZe-jun1(1.ShanghaiVeterinaiyResearchInstitute,CAAS,Shanghai200241.China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity.Hohhot0100189China;3.TianjinShengjiGroupCo.,Lid.,Tianjin300384,China)Abstract:TheEgeneofduckTembusuvirus(DTMUV)wasamplifiedbyRT-PCRandinsertedintothemultipleclonesitesofthepET32a(+)vector.TherecombinantplasmidwastransformedintoBL21(DE3)conipetentcellsandthecellswereinducedwithIPTGtoexpresstheEprotein・SDS-PAGEandWesternBiolassaysshowedthatheEproteinwassuccessfullyexpressedandkepttheactivityforbindingtheDTMUV-specificantibody.BasedonEproteinexpressedinprokaryoticcells,itmightbecomeeasytodevelopdiagnosiskitsandvaccinestorDTMUV.Keywords:Ducktembusuvirus;Egene;cloning;expression自2010年春季以来，中国华东地区发生了以产蛋下降和死亡为主要特征的鸭病的流行，之后该病迅速传播全国多个省市，到目前为止，全国大部分主要水禽养殖地区仍然受到该病的威胁，发病率高达100%,病死率在5%〜10%Z间。经过病毒分离鉴定，目前已经确定引起该病的病原为鸭坦布苏病毒(Ducktembusuvirus,DTMUV)⑴。DTMUV属黃病毒科黃病毒属⑵，呈球型，直径30〜50nm,核心含单股RNA,有衣壳。从序列上分析，该病毒可能与其他黄病毒属的病毒一样，具有3结构蛋白，即E蛋白、核蛋白和白蛋白为糖蛋白。其屮，E蛋白是诱发动物机体产生抗日木乙脑病毒中和抗体的重要抗原［习，黄病毒属中多数病毒的E蛋白与机体宿主的免疫应答作用密切相关，能刺激机体产生屮和抗体和血凝抑制抗体［“】，诱导机体产生持久T记忆细胞，引起保护性免疫反应。收稿日期：2012-02-23基金项目：公益性行业侬业)专项经费(201003012)；国家国际科技合作项H(2010DFB33920)；屮国农业科学院上海兽医研究所中央级公益性科研院所基木科研业务费专项资金项目(2010JB04)作者简介：姬希文，女，硕上研究生，预防兽医学专业通信作者：李泽君,E-mail：lizejun@shvri.ac.cn E蛋白在病毒致病过程中也起关键性作用，该蛋白上一些关键的氨基酸的替代即可引起神经毒力和侵袭力的丧失［叫此外，E基因还与病毒吸附、侵入宿主细胞有关。本研究首次表达和纯化了具有生物学活性的DTMUVE蛋白，为DTMUV早期诊断试剂盒、疫苗与E蛋白结构功能研究奠定了基础。1材料和方法1.1质粒、pET32a(+)表达载体和JM109、BL21(DE3)宿主菌为本试验室保存；限制性内切酶、和T4DNA连接酶为NEB公司；pMD19-T>Ex^gDNA聚合酶、M-MLV逆转录酶购自TaKaRa公司；鼠源多克隆抗体由本实验室制备；HRP标记羊抗鼠IgG为KPL公司。1.2引物设计根据DTMUV奉贤株(FX2010)E基因序列(GenBank:HQ833330.1),利用primer5软件设计一对E基因的特异性引物，预扩增片段长大约1500bp,由上海英骏生物技术有限公司合成,其序列如下:DTMUV-E^RI-UP(上游引物)：5LCACACQAAUCCGAGACTTTGTTGAGGGAGTGAAT・3，DTMUV-X局I-DOWN(下游引物)：5*-CACACCTCGAGGACATGGATATGGGAACTCTACA31.3DTMUVE基因片段的PCR扩增以提取的DTMUV奉贤株RNA为模板，反转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR,操作方法和反应条件如下：以5gLRNA为模板，2gLRandom(TaKaRa公司)为引物，70°C保温10min,迅速冰浴2min,然后分别加入4pL5xM・MLVbuffer、lyLRRl、1|1LM-MLV(TaKaRa公司)、1gLlOmmol/LdNTP、6pLDEPC水，共20gL,混匀后30°C保温10min,42°C水浴1min,75°C10min；将得到的产物进行PCR扩增,反应条件：94°C预变性5min；94°C变性50s,53°C退火lmin；72°C延仲1min30s,30个循环；72°C再延仲15min,10g/L琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，回收冃的片段。1.4目的基因的克隆与鉴定将回收的PCR产物克降入pMD19-T载体上，连接反应体系为：pMD19・TlyL、冃的DNA片段4pL和SolutionI5|.iL；16°C连接2h后，转化E.coliJM109感受态细胞，涂布于含IPTG和X・gal的氨节平板上，37°C恒温培养12〜16h,挑取单个白色菌落接种于含氨节的液体培养基中，37°C220r/min振荡培养，提取质粒DNA,经EcoRI和XhoI双酶切鉴定正确后，将阳性克隆送上海英俊公司测序。1.5重组原核表达载体的构建与鉴定将测序正确的pMD19T-E阳性质粒和原核表达载体pET32a(+)分别用EcoRI和双酶切，分别回收酶切后冃的片段与线性化后的pET-32a(+),加入T4-DNA连接酶于16°C连接过夜，并将连接产物转化E.coliBL21感受态细胞；挑取单菌落进行PCR、酶切鉴定。2结果2.1PCR扩增DTMUVE基因的PCR扩增产物电泳后可见一条约1500bp的条带，与预期片段大小相符(图1)，并且测序结果与目的序列一致。 bpM2200010007505002501001500图1鸭坦布苏病毒E基因的PCR扩增Fig.lPCR-amplifiedEgenefromDTMUVM:DNA分子质量标准(DL2000);1:E基因的PCR产物；2:阴性对照M:DNAMarker(DL2000);1:PCRproductsofEgene;2:Negativecontrol2・2重组表达载体的构建将测序正确的片段与表达载pET32a(+)连接，并转化至大肠杆菌BL21(DE3),挑单菌落培养后，用XhoI和EcoR1双酶切鉴定，可见2条大小分别为5900bp和1500bp左右的片段，与预期结果一致(图2),将该重组质粒命名为pET32a-EoOOOOoooo005050750095250010002501500图2pET32a-E的酶切鉴定Fig.2IdentificationoftherecombinantplasmidpET32a-EbyrestrictionenzymesdigestionM:DNA分子质量标准(DL2000);1:pET32a-E双酶切产物M:DNAMarker(DL2000);1:pET32a-E3讨论鸭坦布苏病毒(DTMUV)与西尼罗病毒(Westnilevirus,WNV)、登革病毒(Denguevirus,DV)同属黄病科黄病痔属成员，推测其E蛋白有着与其他黄病毒E蛋白有着相似的结构和功能oKolaskar等⑺9】的研究表明，E蛋白含有3个抗原域：域I,也称为中心域，由E1位〜E51位、E137位〜E196位和E293位〜E311位的130个氨基酸残基组成，此域有糖基化位点和具有血清学及生物学活性的抗原表位；域II,由E52位〜E136位和E197位〜E292位的181个氨基酸残基组成，具有中和活性和血凝活性的抗原表位；域III,由E312位〜E411位的100个氨基酸残基组成，参与受体结合过程,在黄病毒属中十分保守〔⑼。决定毒力的基因片段主要集屮在E蛋白编码区，E蛋白是病毒表面棘突的主耍成分，它可激发中和抗体和保护性免疫，一般认为它是病毒受体的结合蛋白，并介导膜融合和细胞穿入。 本研究利用PCR技术扩增出了DTMUV完整E蛋白基因片段[⑴，含有形成高级结构所需的所有元件。为了分析原核表达的E蛋白的生物学特性，建立安全、简便和经济的制备DTMUV诊断抗原的方法，笔者构建了DTMUV-E表达载体，并在大肠杆菌中表达。由于大肠杆菌表达菌株BL21(DE3pLysS+)的转化效率相对较低，所以按pET系列载体克隆操作说明的方法，先把目的基因和载体的连接产物克降入大肠杆菌JM109中，筛选出重组质粒后，再把重组质粒转化表达菌株BL21(DE3),最后成功地在大肠杆菌中表达了E蛋白。DTMUV的E蛋片在病毒与敏感细胞结合过程中起着重要的作用，DTMUV敏感细胞表面有病毒的相应受体，但其结构和功能尚未明确。我们用原核表达系统表达E蛋白，在多次尝试不同表达载体与宿主菌之后，成功的构建了E蛋白的原核表达载体。对原核表达产物的可溶性分析结果表明，表达的E蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体裂解后的沉淀中。本研究中E蛋白表达量始终偏低，诱导表达过程中，相同条件下，转入空质粒载体细菌的生长速度，明显高于转入E基因重组质粒载体细菌的生长速度，这可能是E蛋白对细菌细胞有一定毒性有关，今后仍需要优化诱导条件和插入片段的长度等，来提高E蛋白表达量。本实验用原核表达系统，在国内外首次成功表达了具有良好反应活性的DTMUVE蛋白，这为DTMUV的诊断、抗原性分析及功能研究提供了基础。参考文献[1]YanP,ZhaoY,ZhangX,elal.AninfectiousdiseaseofduckscausedbyanewlyemergedTembusuvirusstraininmainlandChina[J].Virology,2011,417(1):1-8.[2]LiY,YcJ,CaoS,etal.ImmunizationwithpscudotypcbaculovirusexpressingenvelopeproteinofJapaneseencephalitisviruselicitsprotectiveimmunityinmice[J].JGeneMed,2009,11(2):150-159.[3]LiP,ZhengQS,WangQ,et«/.ImmuneresponsesofrecombinantadenovirusesexpressingimmunodominantepitopesagainstJapaneseencephalitisvirus[J].Vaccine,2008,26(46):5802-5807.[4]吴玉水•基因工程重组乙型脑炎病毒E蛋门作为候选疫苗和诊断抗原的实验研究[D].第四军供大学博士学位论文,2003.[5]ModisY,OgataS,ClementsD,et^//.Variablesurfaceepitopesinthecrystalstructureofdenguevirustype3envelopeglycoprotein[J],JVirol,2005,79(2):1223-31.[6]NybakkenGE,NelsonCA,ChenBR,etal.CrystalstructureoftheWestNilevirusenvelopeglycoprotein[J].JVirol,2006,80(23):H467-11474.[7]StiasnyK,KosslC,LcpaultJ,etal.CharacterizationofaStructuralIntermediateofFlavivirusMembraneFusion[J]・PLoSPathog,2007,3(2):20[8]SambrookJ,FritschEF,Maniatis,T.分子克隆实验指南[M].2版,金冬雁,黎孟枫,译,北京：科学出版社,1989,49-56,845-848,876-887.[9]WangJW,FuSH,WangHY,etal.IsolationandidentificationofJapaneseencephalitisvirusinLiaoningprovincc[J]?|4华实验和临床病毒学杂志,2006,20(1):61-65.[10]VermaSK,GuptaN,PattnaikP,etal.Antibodiesagainstrefoldedrecombinantenvelopeprotcin(domainIII)ofJapanesecnccphalitisvirusinhibittheDTMUVinfectiontoporcinestablckidneycclls[J].ProteinPeptLett,2009,16(11):1334-1341.[11]吕晓丽，崔保安，陈红英，等.复合RT-PCR检测猪乙脑病毒和猪流感病毒方法的建立[J].华南农业大学学报，200&29(4):79-82.[12]VermaSK,KumarS,GuptaN,etal.BactcriallyexpressedrccombinantenvelopeproteindomainIIIofJapaneseencephalitisvirus(rDTMUVDIII)elicitsTh1typeofimmuneresponseinBALB/cmice[J].Vaccine,2009,27(49)：6905-6909.[13]NabeshimaT,LoanIIT,InoneS,etal.EvidenceoffrequentintroductionsofJapaneseencephalitisvirusfromsoutheastAsiaandcontinentaleastAsiatoJapanfJ].JGenViro,2009,90(Pt4):827-832.