原核诱导表达

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1、原核诱导表达的标准操作程序（SOP）一．目的：使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。二．适用范围：本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。三．实验原理：E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点

2、共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代

3、谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。四、试剂准备:（一）实验器材的灭菌：枪头的灭菌：1mL，200µL，20µL的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常温放置。螺口管及离心管的灭菌：将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常温放置。50mL离心管的灭菌：将50mL离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常温放置。（二）LB培养基的

4、配制液体LB培养基（1L）：蛋白胨10g氯化钠10g酵母提取物5g调PH值到7.5，高压灭菌，4℃保存。固体LB培养基（1L）：蛋白胨10g13氯化钠10g酵母提取物5g琼脂粉15g高压灭菌，不烫手的情况下加入抗性，抗性：培养基=1：1000（氨苄，卡那通常浓度），混匀。马上在无菌操作台中倒平板，并开大风吹干。用封口膜封住，倒置放于4℃保存。（三）1MIPTG的配制：经过计算，10gIPTG可以配42ml的1MIPTG。买来的粉末状的IPTG一般全部配成1MIPTG。1、无菌操作台紫外线照射，后通风。2、用少量去离子水将IPT

5、G溶解完全，并定容。3、在无菌操作台中，用0.22µm的滤器将配好的IPTG滤入灭菌后的1.5ml离心管中，过滤除菌，-20℃保存。注意事项：在用滤器将IPTG滤入离心管时，先用针头吸IPTG，然后将枪头拔掉，排出气体，滤头加入IPTG液，在使针管与滤器相连，保证整个装置无气体进入。滤的过程中，手不能碰滤头。（四）3×SDS-PAGEloadingbuffer的配制：3×SDS-PAGEloadingbuffer10ml1MTris-Hcl(PH6.8)1.5mlSDS0.6gBPB(溴酚蓝)30mg甘油（丙三醇）3ml去离子

6、水5.5ml1．将除BPB以外的药品完全溶解。SDS常温下很难溶解，可以在37℃水浴溶解。完全溶解后，再加入BPB，进行溶解。2．把溶好的buffer分装到1.5ml的离心管中，1ml/管，常温放置。3．使用前，每管加入30µL巯基乙醇。注意事项：巯基乙醇为危险品，加入的过程在通风橱中完成，并且带好手套。（五）10×PBS的配制：0.1MPBS（10×PBS）1LNaH2PO4.2H2O2.83gNacl85gNa2HPO4.12H2O28.98g13用去离子水将以上药品进行溶解。（溶解的非常慢，可能需要过夜）调PH值到7.2

7、，用0.4µm的滤膜过滤。常温保存。工作时用的是1×PBS。（六）1.5MTris-Hcl(PH8.8)的配制：1.5MTris-Hcl250mlTris45.425g1．用200ml去离子水将Tris溶解。2．用浓盐酸调PH值到8.8。3．调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。4．0.4µm的滤膜过滤，常温保存。注意事项：Tris的缓冲能力很强，调PH值时，费些时间，但不要调过。（七）1MTris-Hcl(PH6.8)的配制：1MTris-Hcl250mlTris30.275g1．用200ml去离子水将Tris溶解。2

8、．用浓盐酸调PH值到6.83．调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。4．0.4µm的滤膜过滤，常温保存。（八）30%丙烯酰胺的配制：30%丙烯酰胺250ml丙烯酰胺72.5mlBIS甲叉丙烯酰胺2.5ml1．把药品用去离子水溶解后定容到250ml。2．用滤纸过滤，放在棕