jc病毒蛋白vp3原核表达载体的构建及诱导表达

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1、JC病毒蛋白VP3原核表达载体的构建及诱导表达：李小权，毛羽，郑铁龙，成军，张树林，王琦，李兴旺【摘要】目的构建JC病毒蛋白VP3原核表达载体，并观察其表达情况。方法通过聚合酶链式反应(PCR)获得VP3基因，将其连接到pGEMT载体，测序正确后插入至原核表达载体pET32a(+)中，转化BL21大肠杆菌，IPTG诱导，并通过十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)、ethodsTheDNAfragmentofvp3plifiedbypolymerasechainreaction(PCR),andclonedintopGEMTvec

2、tor.Aftersequencing,thecorrectDNAfragmentedintoE.coliBL21.TheproteindodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresisandL)患者的病灶中发现并分离出JC病毒，该病毒具有明显的嗜神经性特点,有致瘤性，而且与某些类型的脑瘤有关。目前普遍认为，儿童期的JC病毒的感染率可能高达65%，因为多无明显的症状，故不会引起人们的注意[2]。JC病毒具体的传播途径目前尚不清楚。大多数研究认为该病是经粪口途径传播的[3]，但是也有人认为其是母婴传播[4]。虽

3、然多数人可能从幼年已经开始感染该病原，但是只有免疫严重缺陷的患者发病，尤其是细胞免疫缺陷的患者[2]。研究发现，JC病毒编码包括VP3在内的有6种蛋白，但其功能尚不清楚[5]。为了进一步研究JC病毒的生物学功能，我们构建了JC病毒的VP3原核表达载体，观察重组VP3蛋白在大肠杆菌中的表达。1材料与方法1.1材料1.1.1材料菌株、载体、大肠杆菌DH5α、大肠埃希菌BL21及原核表达载体pET32a(+)为本室保存；扩增JC病毒VP3基因的材料人免疫缺陷病毒(HIV)感染者的脑脊液从本院获取；pGEMT载体购于Promega公司。1.1.2主要试剂T

4、aq酶购于鼎国生物公司；丙烯酰胺、N，N′亚甲双丙烯酰胺、T4DNA连接酶、IPTG购于Promega公司；玻璃奶回收试剂盒购自博大泰克公司；BamHⅠ、AvalⅠ购自TaKaRa(大连)公司；抗His单克隆抗体购自SantaCruz公司；HRP标记羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物公司；化学发光底物购自Pierce公司；PVDF膜购自Millipore公司；其余化学试剂均为国产分析纯和生化试剂。引物合成及DNA测序由Invitrogen公司完成。1.2方法1.2.1VP3基因的扩增根据VP3基因序列，在编码区的上游和下游设计合成一对寡聚核苷酸引物(P

5、1：5′CGGGATCCATGGCTTTACAATTATTTAATC3′；P2：5′CCGCTCGAGACTTCTAGAACTTCTACTCCTC3′)，引物两端分别引入BamHⅠ和AvalⅠ酶切位点。以HIV患者的脑脊液为模板，经PCR扩增获得VP3全长序列。反应条件：95℃5min，94℃45s、58℃45s、72℃45s35循环，72℃延伸7min，4℃∝。10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，切胶玻璃奶法纯化回收。1.2.2重组表达质粒pET32a(+)VP3的构建将纯化回收的目的基因片段与pGEMT载体16℃条件下T4DNA连接

6、酶连接过夜，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，铺于含有氨苄青霉素的LB的平板上37℃孵育16h。挑取白色菌落行菌落PCR，碱裂解法提取阳性克隆质粒并进行BamHⅠ/AvalⅠ双酶切鉴定，证明目的基因片段已插入pGEMT载体中后，送生物公司测序。测序显示正确后用BamHⅠ/AvalⅠ从pGEMT克隆质粒上酶切目的基因片段，10g/L琼脂糖凝胶电泳纯化回收，与经BamHⅠ/AvalⅠ酶切的pET32a(+)表达质粒连接。连接产物转化表达菌株大肠埃希菌BL21，平板于37℃孵育过夜后进行菌落PCR，阳性菌落扩增菌摇菌提质粒并用BamHⅠ/AvalⅠ双酶

7、切质粒鉴定。1.2.4VP3重组蛋白的抗原性检测—T载体，经测序及BamHⅠ/AvalⅠ双酶切鉴定正确后，插入表达载体pET32a(+)相应酶切位点上，经转化、提质粒后BamHⅠ/AvalⅠ行双酶切鉴定，结果表明重组表达载体pET32a(+)VP3构建成功(图2、图3)。2.3VP3重组蛋白的表达和L病密切相关。随着免疫抑制患者的增多，探讨JC病毒的致病机理就显得尤为重要。将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法，一般称为原核表达[6]。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。作为研究最为详尽的原核细菌，大肠杆菌用

8、于重组蛋白的表达具有易于生长和控制的特点，用于细菌培养的材料便宜，而且有各种各样的大肠杆菌菌株