蚯蚓抗菌肽提取及其活性探究

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1、蚯蚓抗菌肽提取及其活性探究摘要：以野生蚯蚓为原料，用磷酸盐缓冲液浸提，经高速冷冻离心机粗提和SephadexG-75分离得到多肽，并通过对大肠杆菌和枯草芽鞄杆菌抑菌试验，实验结果表明：分离出的分子量较小的蚯蚓抗菌肽对大肠杆菌有较强的抑制性，而对枯草芽胞杆菌的抑制性相对较弱。关键词：蚯蚓；SephadexG-75；大肠杆菌；枯草芽胞中图分类号：Q501文献标识码：A文章编号：1009-8631(2011)05-0174-02引言抗菌肽是一类具有热稳定性的碱性小肽［1］,分子量小,约为4kDa,等电点为&9〜10.7,最初是从西枯比天蚕中分离的，后来又从其它昆虫中分离出不同类别的

2、抗菌肽。天然的抗菌肽是昆虫免疫系统血淋巴中的一类抗菌多肽，人工合成的抗菌肽是通过基因工程或诱导的方法分离提纯而获得的。这些抗菌肽具有同样的特征：N端富含带有极性氨基酸，呈强碱性；C端为中性疏水性。抗菌肽具有的广谱抗微生物活性［2］,不仅能杀死细菌、真菌、原虫等病原微生物,抑制病毒的繁殖与扩散，而且也能杀死癌细胞［3］。其最小抑制浓度(MIC)为0.25g/m〜4g/ml。特别对一些耐药菌，如伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌等也同样敏感［4］。蚯蚓，特别是用于人工饲养和处理生活垃圾等废弃物的蚯蚓，生活在充满各种微生物［5］,甚至大量致病微生物的环境中，因此其必然有经过长期进化而形成的抵

3、抗外来微生物侵袭的机制，对此进行研究，亦应具有潜在的理论和应用价值。1试验1.1原料与设备蚯蚓，天然野生蚯蚓；大肠杆菌、枯草芽胞杆菌，院动科实验室；葡聚糖凝胶，上海市长征制药厂；培养基，LB培养基；超声波细胞粉碎仪，JY92-2D型；台式高速冷冻离心机，TGL-16G型。1.2试验方法1.2.1蚯蚓抗菌肽的提取分离取新鲜的蚯蚓50条，在水中浸泡24h,使其吐出肠道中的泥沙等异物［6］,用水洗干净后，加入2倍体积的0.2mol/L、pH值为6.0的磷酸盐缓冲溶液，用高速组织捣碎机捣碎，然后用超声波细胞破碎仪破碎，破碎时将装有待破碎蚯蚓的容器埋入冰中，用以散热，防止因过热而导致蛋

4、白质变性，每次工作2秒、休息3秒，破碎20次，功率由0w逐渐升到600wo破碎后真空抽滤，收取含蚯蚓抗菌肽的过滤液并保存在保温瓶中，以备再用。1.2.2抗菌肽的粗分离将等质量的粗提液分装在离心试管中，在冷冻离心机内的温度保持在0£〜8£条件下，于4£开始高速冷冻离心分离，转速由0r/min逐渐升到10000r/min,定时20mino用移液枪取离心后的上清液，放入盛有冰块的保温桶内，以备上样。1.2.3葡聚糖凝胶(SephadexG-75)柱层析(1)装柱和上样：取一定量的葡聚糖凝胶(SephadexG-75),在水中充分溶胀24h后，采用湿法装柱；装好的层析柱，至少要用3倍

5、于层析床体积的0.2mol/L乙酸鞍洗脱液平衡，待液面在床表面上1mm〜2mm时，关闭出口，距床表面上lcm沿柱壁圆周将样品注入，加样量为床体积的10%〜15%；加完样打开出口，使样品完全渗入层析床；最后在柱床上面覆一薄层脱脂棉，以保护柱床表面，并且加样时，样品溶液的体积要小，尽量浓，这样流出的峰形好。(2)洗脱和收集：洗脱时选用乙酸铁为洗脱液，凝胶柱装好后洗脱液洗脱到出现基线，然后进行梯度洗脱，每20min收集一管，为6ml；将收集得到的样品放入冰箱中冷冻保存，并用平板打孔法对所收集的各管样品做抑菌活性测试。1.3抗菌肽检测(1)平板打孔法测抑菌性：以大肠杆菌和枯草芽鞄杆菌

6、为受抑菌，普通琼脂培养基为菌体培养基。按要求打孔[7],以便利于观察。用无菌吸管吸取菌液注入平板后，并均匀涂布[8],在371下培养12h〜18h,观察抑菌效果。(2)紫外光谱吸收：将测试有抑菌性的样品[9],按照相应(V样品：V乙酸铁=1：6)比例进行稀释，在紫外区进行紫外吸收光谱的测定，并记下最大吸收峰处的波长和吸光度，并观察其峰形。2结果与分析1.1乙酸铁洗脱液浓度的选择为了提取蚯蚓中可能的有效抗菌肽，乙酸錢洗脱液的浓度从0.2mol/L〜1.0mol/L,对收集的样品进行抑菌试验，选择一个最佳的乙酸铁浓度。试验结果表明，该浓度区间洗脱的样品对大肠杆菌均有不同的抑菌作用

7、，其中0.2inol/L下的效果较好，选取0•加ol/L为最佳浓度。2.2粗提液中抗菌肽的抑菌效果为研究蚯蚓抗菌肽的作用效果，以及优化选择试验菌种，首先研究了粗提液对大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的抑菌效果[10],并利用磷酸盐缓冲液对大肠杆菌的抑菌试验验证了蚯蚓抗菌肽的活性，通过对比发现，蚯蚓抗菌肽对大肠杆菌有抗菌活性，而对枯草芽胞杆菌的抗菌活性不明显，如图1和图2所示，所以研究选用大肠杆菌作为试验研究对象。1.3分离液中抗菌肽的抑菌效果粗提物经SephadexG-75层析柱提纯时，层析柱分为4个颜色，由下到