实验 酵母醇脱氢酶的提纯及其性质的研究

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1、实验三酵母醇脱氢酶的提纯及其性质的研究醇脱氢酶（ADH）是生物体内重要的氧化还原催化剂之一，在生物催化、生物医学领域都有较为广泛的应用。生物体内的很多醇类代谢都是通过醇脱氢酶催化完成的。醇脱氢酶来源广泛，种类繁多，可按肽链长度分为短链、中链、长链醇脱氢酶，所含肽链氨基酸残基数分别为250、375和600~750，酵母醇脱氢酶（YADH）是其中研究和应用最为广泛的一种。酵母醇脱氢酶以NAD+/NADH为辅酶，可逆催化醇和醛/酮之间的氧化还原反应。酵母醇脱氢酶为四聚体，单个亚基肽链含347个氨基酸残基，亚基相对分子质量为35000。（一）酵母醇脱氢酶的提纯一、实

2、验目的1.学习和掌握醇脱氢酶提纯的原理和方法；2.掌握醇脱氢酶活力的测定方法。二、实验原理以酵母为原料，利用热变性、有机溶剂沉淀蛋白质等方法，提取具有一定纯度的酵母醇脱氢酶。在提纯过程中，每经一步提纯处理，都需测定酶蛋白质含量和活力，并计算得比活力(本实验中比活力=活力单位数/mg蛋白质)。唯有比活力提高了，才证明所用提纯措施有效，酶制剂的纯度提高了。醇脱氢酶的辅酶NAD（以NAD为辅酶的醇脱氢酶，它只作用于一级醇、二级醇和半缩醛脱氢酶，动物醇脱氢酶还能催化环一级醇脱氢，酵母醇脱氢酶无此活力。另有以NADP为辅酶的醇脱氢酶，它只作用于一级醇。），它能催化乙醇

3、脱氢变成乙醛，脱下的氢则使NAD+还原。CH3CH2OH+NAD+→CH3CHO+NADH+H+当有过量的醇存在时，NAD+被还原的速度与酶活力成正比，酶活力愈高，单位时间产生的NADH愈多。NADH对340nm紫外线有较强吸收，NAD+无此能力，因此可用测定A340nm的方法测得反应体系中NADH含量，从而得知酶活力的大小。0本实验用Folin-酚试剂法测定蛋白质含量三、实验材料、仪器和试剂1．实验仪器：（1）干酵母粉：将鲜酵母分散成小块，放在搪瓷盘吹干。干燥后，研磨成粉末。（2）烧杯（3）吸管0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml（4）容量瓶（5

4、）试管（6）量筒（7）水浴锅（8）台天平（9）电子天平（10）离心机（5000r/min）（11）722型分光光度计（12）UV-900型紫外可见分光光度计2．实验试剂：（1）3mol/L乙醇溶液：量取无水乙醇（比重：0.789，相对分子质量：46.07）174.6ml，加蒸馏水稀释至1000ml。（2）0.06mol/L焦磷酸钠溶液（pH8.5）：称取焦磷酸钠（Na4P2O2·10H2O）22.56g，溶于蒸馏水，稀释至1000ml。（3）0.0015mol/LNAD溶液：称取NAD0.0995g（NAD相对分子质量：663.44）溶于蒸馏水，稀释至100

5、0ml。（4）0.01mol/L磷酸氢二钾溶液：溶1.74gK2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml。（5）丙酮（A.R.）（6）0.066mol/L磷酸氢二钠溶液：溶9.37gNa2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml。四、实验操作步骤1．酵母醇脱氢酶的提纯（1）粗提置20g干酵母于250ml烧杯中，加0.066mol/LNa2HPO4溶液80ml，37℃水浴锅保温2h，不断搅拌、再于室温提取3h，离心20min（4000r/min）取上清液3ml，测定蛋白质含量及酶活力，其余上清液量得体积后，倾于150ml烧杯中。（2）热变性沉淀杂蛋白将上清液55℃保温

6、15~20min，不断慢速搅拌。保温毕，立即置冷水中冷却，离心20min（4℃，4000r/min）。吸取上清液3ml，测蛋白质含量及酶活力。其余上清液量得体积后，倾于烧杯中。（3）有机溶剂沉淀杂蛋白将上清液置盐冰浴中降温至-2℃以下，按100ml上清液加50ml丙酮的比例加入预先冷至-2℃以下的丙酮，边加边搅。加毕，放置片刻，低温离心20min（0℃，4000r/min）。吸取上清液3ml，测蛋白质含量及酶活力。其余上清液量得体积后，倾入已置于盐冰浴的烧杯中。（4）有机溶剂沉淀酶蛋白按100ml上清液加55ml丙酮的比例，逐滴加入冰冷的丙酮，使溶液保持-2

7、℃以下。待沉淀完全后，低温离心15min（0℃，4000r/min）。弃去上清液，沉淀溶于少量蒸馏水，转移至透析袋内，对冷水透析3h（在冰箱中进行）。离心除去沉淀，上清液即为达到一定纯度的醇脱氢酶制剂。2.蛋白质浓度的测定吸取1、2、3步骤所取的样液及最后制得的酶制剂0.5ml，用蒸馏水稀释100~200倍。按考马斯亮蓝法或紫外吸收法测定蛋白质含量。3.酶活力测定样液及酶制剂均需用0.01mol/LK2HPO4溶液稀释，稀释倍数如下：V1（粗提取液）：V（Na2HPO4）=1：4（或1：9）V2（热变性去杂蛋白样液）：V（Na2HPO4）=1：9（或1：19

8、）V3（有机溶剂去杂蛋白样液）：V（Na2HPO4）