《我国东北三省蝙蝠病毒组学及其新病毒的鉴定.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
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目录缩略词.............................................................................................................................I伦理证明.......................................................................................................................III摘要................................................................................................................................VAbstract.........................................................................................................................IX前言................................................................................................................................1第一章东北三省蝙蝠病毒宏基因组学研究................................................................31.1材料........................................................................................................................31.1.1蝙蝠样本............................................................................................................31.1.2主要试剂及耗材................................................................................................61.1.3实验仪器............................................................................................................61.1.4生物信息学软件................................................................................................61.2方法........................................................................................................................71.2.1蝙蝠种类鉴定....................................................................................................71.2.2病毒宏基因组学处理.........................................................................................81.2.3病毒宏基因组学测序........................................................................................81.2.4病毒验证............................................................................................................81.3结果......................................................................................................................111.3.1蝙蝠种类鉴定及样品采集信息......................................................................111.3.2病毒宏基因组学分析结果..............................................................................111.3.3病毒序列分析及检测结果..............................................................................141.4讨论......................................................................................................................27第二章新型蝙蝠病毒的鉴定....................................................................................332.1材料......................................................................................................................332.1.1蝙蝠样品..........................................................................................................332.1.2试剂及耗材......................................................................................................332.1.3细胞系..............................................................................................................332.1.4实验仪器..........................................................................................................342.1.5生物信息学软件..............................................................................................342.2方法......................................................................................................................342.2.1病毒核酸提取..................................................................................................342.2.2引物设计..........................................................................................................342.2.3蝙蝠样品检测..................................................................................................35 2.2.4病毒全基因组扩增及测序..............................................................................352.2.5病毒分离..........................................................................................................422.3结果......................................................................................................................422.3.1蝙蝠圆环病毒鉴定结果..................................................................................422.3.2蝙蝠布尼亚病毒鉴定结果..............................................................................492.3.3蝙蝠副粘病毒鉴定结果..................................................................................522.3.4蝙蝠冠状病毒鉴定结果..................................................................................552.4讨论......................................................................................................................58结论..............................................................................................................................63参考文献......................................................................................................................65附录..............................................................................................................................75个人简介......................................................................................................................95致谢..........................................................................................................................97 缩略词英文缩写英文名称中文名称AAAminoacids氨基酸ADPrimerArbitraryDegeneratePrimer随机简并引物BHK-21Babyhamsterkidneycellline-21幼仓鼠肾细胞BLASTBasiclocalalignmentsearchtool基本局部匹配查询工具bpBasepair碱基对BunVBunyavirus布尼亚病毒cDNAComplementaryDNA互补DNACoVCoronavirus冠状病毒CVCircovirus圆环病毒ddH2ODoubledistilledwater双蒸水DMEMDulbecco'smodifiedeagle'smedium改良伊戈尔培养基DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyribonucleictriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸ICTVInternationalcommitteeontaxonomyofviruses国际病毒分类委员会kbkilobases千碱基LBLysogenybroth溶菌肉汤MERSMiddleEastrespiratorysyndrome中东呼吸道综合征minMinute分钟NCBINationalCenterforBiotechnologyInformation美国国立生物技术信息中心I nrNonredundantdatabase非冗余数据库ntNucleotide核苷酸OIEOfficeinternationalepizooties世界动物卫生组织ORFOpenreadingframe开放性阅读框PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应RACERapidamplificationofcDNAendscDNA末端的快速扩增RNARibonucleicAcid核糖核酸RT-PCRReversetranscriptionalpolymerasechainreaction逆转录聚合酶链反应SARSSevereacuterespirationsyndromes非典型肺炎secSecond秒SISPASequence-independentsingleprimeramplification序列非依赖性单引物扩增SPSpecificPrimer特异性引物Vero/Vero-E6Verdarenocellline非洲绿猴肾细胞II 伦理证明本课题涉及到的蝙蝠采集操作得到了军事医学科学院动物伦理委员会批准（批准号JSY-DW-2010-02），同时完全严格按照科技部《关于善待实验动物的指导性》（国科发财字[2006]398号）执行。III 摘要蝙蝠是世界上仅次于啮齿类动物的种类最为丰富的哺乳动物，分布在除两极的所有陆地。同时，蝙蝠又是重要的病毒储存库，能携带至少170种病毒，包括一些人兽共患病毒，如狂犬病毒、亨德拉病毒、埃博拉病毒、博卡病毒等。在我国有120种蝙蝠，分属于12个蝙蝠科30个蝙蝠属，广泛分布在我国的多个地区。东北三省包括辽宁、吉林和黑龙江，与俄罗斯和朝鲜接壤，具有重要的战略地位；该地区地域辽阔，气候独特，蝙蝠资源目前没有系统的数据，而关于我国东北地区蝙蝠携带病毒的数据更是严重缺乏，仅发现了蝙蝠伊库特病毒（Irkutvirus，狂犬病毒属成员）、博卡病毒和冠状病毒，因而系统全面调查我国东北三省蝙蝠携带病毒的多样性和遗传多态性，对于了解东北地区蝙蝠病毒的本地情况具有重要的意义。本研究在2013-2014年间，于东北三省实地考察了16个市的蝙蝠生态情况，结果在6个市发现了蝙蝠，其种类主要是马铁菊头蝠、大足鼠耳蝠、白腹管鼻蝠和东方蝙蝠等，我们在这些市设置了10个蝙蝠病毒监测点，共采集了204只蝙蝠样本。通过本实验室已建立的病毒宏基因组学方法对以上样本进行病毒组分析，发现了22个科的病毒，其中注释到脊椎动物病毒有16个科20个属32个种，如白蛉热病毒、α冠状病毒和β冠状病毒、人副流感病毒4型、星状病毒以及博卡病毒等；昆虫病毒6个科，如Baculoviridae、Dicistroviridae、Iflaviridae、Parvoviridae（Ambidensovirus）、Polydnaviridae和Tetraviridaes等；还发现一个植物病毒科，Phycodnaviridae。本研究主要关注脊椎动物病毒，根据病毒宏基因组学分析结果，对星状病毒、水泡性病毒、细小病毒、小RNA病毒、环状病毒、布尼亚病毒、圆环病毒、冠状病毒等进行了鉴定分析。从辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中，有病毒序列注释到了星状病毒科，在这些星状病毒序列中，与不丹国人星状病毒BtnMLB1-86同源性最高，为84%。弹状病毒科中的水疱性病毒序列发现于辽宁本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中，其中水疱性病毒与美国蝙蝠水疱性病毒TFFN-2013株同源性最高，为64.3%。使用特异性PCR筛查，从辽宁省本溪市溪湖区6只马铁菊头蝠中检测到2只蝙蝠携带水泡性病毒，阳性率为33.3%；从辽宁省本溪市本溪县4只马铁菊头蝠中检测到1只蝙蝠携带水泡性病毒，阳性率为25.0%；从辽宁省本溪市恒仁县2只马铁菊头蝠中全部检测到水泡性病毒，阳性率为100%。小RNA病毒科的心病毒序列发现于吉林省的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中，其中心病毒序列与刚果蝙蝠环状病毒PREDICT-06105同源性最高，V 为84%；并在吉林省通化市的28只大足鼠耳蝠中，检测出9只蝙蝠携带有心病毒，阳性率为33.3%。病毒宏基因组学结果中，注释到了细小病毒科博卡细小病毒属和依赖细小病毒属，在吉林省通化市的29只马铁菊头蝠中，检测出19只蝙蝠携带博卡病毒，阳性率为65.5%；在辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠、吉林省通化市的白腹管鼻蝠以及黑龙江省的东方蝙蝠中，均发现有病毒序列注释到细小病毒科依赖细小病毒属，这三株细小病毒均与我国蝙蝠腺联病毒YNM株有最高同源，分别为84%、89%以及87%，并且它们均与依赖细小病毒属病毒处在同一进化分支。注释到了呼肠孤病毒科的环状病毒的病毒序列，来源于于辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中，与澳大利亚环状病毒属的Eubenangeevirus具有最高同源性，为79%，并在辽宁省本溪市的29只大足鼠耳蝠中，检测出4只蝙蝠携带有环状病毒，阳性率为13.8%。。同时，这株蝙蝠环状病毒是国内首次从蝙蝠中检测到的。另外，通过特异性PCR验证，从黑龙江省的蝙蝠中，检测到了两株圆环病毒，一株是在哈尔滨市阿城区的43只东方蝙蝠中，检测出2只蝙蝠有圆环病毒基因存在，阳性率为4.7%；另外一株是在大庆市萨尔图区的9只东方蝙蝠中检测到1只蝙蝠携带圆环病毒，阳性率为11.1%。在吉林省通化市的40只白腹管鼻蝠中，检测出2只蝙蝠含有腮腺炎病毒属（Rubulavirus）病毒基因，阳性率为5%。从吉林省通化市的29只马铁菊头蝠中，检测到有8只马铁菊头蝠携带有布尼亚病毒基因，阳性率为27.6%。对于冠状病毒的检测，一株是从吉林省通化市的40只白腹管鼻蝠中检测出一只蝙蝠携带α冠状病毒属的冠状病毒基因，阳性率为2.5%，另外一株是从吉林省通化市的29只马铁菊头蝠检测出一只蝙蝠携带有β冠状病毒属的冠状病毒基因，阳性率为3.5%。针对以上鉴定结果，挑取了圆环病毒、布尼亚病毒、副粘病毒和冠状病毒进行了更进一步的研究。对两株圆环病毒进行全基因组学分析，获得了长2117nt和2113nt基因组序列。对基因组预测分析，在复制原点处，均存在茎环结构；还都存在poly（T）结构。系统进化分析，蝙蝠圆环病毒的全基因组序列与圆环病毒属VS7100003株狐狸圆环病毒存在最高同源性，通过系统进化分析，发现也与这株狐狸圆环病毒处在同一进化分支，均为圆环病毒属成员，这是东北三省首次发现蝙蝠圆环病毒。对白蛉热病毒属的这株布尼亚病毒进行分析，发现与我国陕西Rp-BunyaV/Shaanxi2011株蝙蝠布尼亚病毒存在最高同源，并且同处同一进化分支，与白蛉热病毒属病毒近缘，这是东北三省首次发现蝙蝠布尼亚病毒。获得了5318nt长的蝙蝠副粘病毒基因序列，分析发现与人副流感病毒4型具有最高的同源性，并且均处在同一进化分支，均为腮腺炎病毒属病毒，这是东北三省首次发现蝙蝠副流感病毒。在吉林省通化市，获得了JTAC2株α冠状病毒和JTMC15株β冠状病毒两株冠状病毒，基因分析发现JTAC2株α冠状病毒与我VI 国Neixiang14株冠状病毒具有最高同源性，同时也处在α冠状病毒属内的同一进化分支中；JTMC15株β冠状病毒与Rf1株SARS样冠状病毒具有最高的同源性，均处β冠状病毒属β2群中，均为β冠状病毒属病毒，同时，也发现JTMC15株β冠状病毒存在整个基因8缺失的现象。本研究使用病毒宏基因学方法首次对东北三省的蝙蝠病毒组全面调查，获得了大量的蝙蝠病毒组信息；鉴定了13种脊椎动物病毒，其中包括星状病毒、细小病毒、小RNA病毒、水泡性病毒、环状病毒、圆环病毒、布尼亚病毒、副粘病毒以及冠状病毒等，并对其中圆环病毒、布尼亚病毒、副粘病毒以及冠状病毒进行了进一步分析，获得了圆环病毒和两株冠状病毒全基因组序列。而在这些病毒种，有很多病毒为首次在东北三省发现，比如星状病毒、水泡性病毒、细小病毒、小RNA病毒、布尼亚病毒、圆环病毒、α冠状病毒等。另外，依据病毒宏基因组病毒序列及其注释信息，也能够找出这些病毒序列对应的蝙蝠样品信息，大大提高了对蝙蝠携带病毒信息的发掘效率，体现出了病毒宏基因组学分析的优势性，这也说明病毒宏基因组学分析手段在发现新型病毒的工作中，能够起到突破性的作用。同时也发现了东北三省蝙蝠携带大量的蝙蝠源病毒，获得了东北三省蝙蝠携带病毒的本底数据，也进一步丰富了蝙蝠病毒的数据库，了解了蝙蝠病毒的多样性，系统获得了东北三省蝙蝠携带病毒组的情况。同时，也获得了东北三省蝙蝠栖息环境情况，为以后了解蝙蝠栖息环境提供了基础数据。关键词：东北三省，蝙蝠病毒，病毒宏基因组学分析，病毒鉴定。VII AbstractBatsarethesecondlargestmammalintheworldanddistributedthroughoutalllandsexceptthetwopoles.Atthesametime,theyarealsoanimportantrepositoryandcouldcarryatleastonehundredandseventykindsofviruses,includingsomezoonoticviruses,suchasrabiesvirus,hendravirus,ebolavirus,bocavirusandsoon.ThereareatleastonehundredandtwentybatspeciesfromthirtybatgenerafromtwelvefamiliesinChina,andbatsarewidelydistributedinmanypartsofChina.ThreenortheastprovincesofChina,includingLiaoningprovince,JilinprovinceandHeilongjiangprovince,adheretotheborderofRussiaandNorthKorea,whichareimportantstrategicposition.Thevastterritoryandtheuniqueclimateleadtothelackofthesystematicdataofbat.Sofar,Irkutvirusfromthelyssavirus,bocavirusandcoronaviruswereonlyfoundinthreenortheastprovincesofChina,soit’simportantsignificancetosystematicallycomprehensivesurveythenaturalbackgroundandgeneticpolymorphismthatbatscarryvirusestofillgapsofbatvirusesinthreenortheastprovincesofChina.Twohundredandfourhealthybats,includingMyotisricketti,Rhinolophusferrumequinum,MurinaleucogasterandVespertilioorientalis,werecollectedatthesixcitiesfromthesixteencitiesoffieldtripswithbatecologicalsituationin2013and2014.Byviralmetagenomicanalysis,twenty-twoviralfamilieswerefound,whichincludesthirty-twoviralspeciesfromtwentyviralgenerafromvertebratevirusessuchasphlebovirus,alphacoronavirusandbetacoronavirus,humanparainfluenzavirus4a,astrovirusandsoon,andincludessixinsectviralfamiliesBaculoviridae,Dicistroviridae,Iflaviridae,Parvoviridae(Ambidensovirus),Polydnaviridae,Tetraviridaeandsoon,andincludesoneplantviralfamilies,suchasPhycodnaviridae.Accordingtotheresultsofviralmetagenomics,astrovirus,parvovirus,vesiculovirus,orbivirus,bunyavirus,cirovirus,coronavirusandothersignificantviruseswereidentifiedandanalyzed.TheviralsequencesannotatedtoastroviridaewerefoundinthebatsofMyotisrickettiandRhinolophusferrumequinuminBenxicity,Liaoningprovince,andhadthe84%highestwithBhutanastrovirusMLB1.TheviralsequencesannotatedtothevesiculovirusfromrhabdoviridaewerefoundinthebatsofMyotisrickettiandRhinolophusferrumequinuminBenxicity,Liaoningprovince,andhadthe64.3%highestwithAmericanbatvesiculovirusofTFFN-2013.TwobatsofRhinolophusferrumequinumcarriedvesiculovirusfromthesixbatsininXihuIX districtofBenxicityinLiaoningProvincewereacquiredandthepositiveratewas33.3%.OnebatofRhinolophusferrumequinumcarriedthevesiculovirusfromthefourbatsininBenxicountyofBenxicityinLiaoningProvincewereacquiredandthepositiveratewas25.0%.AllbatsofRhinolophusferrumequinumcarriedthevesiculovirusfromthetwobatsininHengrencountyofBenxicityinLiaoningProvincewereacquiredandthepositiveratewas100%.Theidentificationanalysisofpicornavirus,wefoundviralsequenceinbatsofMyotisrickettiandRhinolophusferrumequinuminTonghuacity,JilinProvinceannotatedtothecardiovirusfrompicornaviridae,andhadthe84%highestidentitywithAfricanbaticavirusaftertheanalysis.NinebatsofMyotisricketticarriedthecardiovirusfrompicornaviridaefromthetwenty-eightbatsinTonghuaCity,JilinProvincewereacquiredandthepositiveratewas33.3%.NineteenbatsofRhinolophusferrumequinumcarriedthebocavirusfrombocaparvovirusfromparvoviridaefromthetwenty-ninebatsininTonghuaCity,JilinProvincewereacquiredandthepositiveratewas65.5%.MyotisrickettiandRhinolophusferrumequinuminLiaoningprovince,andMurinaleucogasterinJilinprovince,andVespertilioorientalisinHeilongjiangprovincehadviralsequenceswhichannotatedtodependoparvovirusfromparvoviridae.Theseviruseshadthehighestidentityasbatadeno-associatedvirusYNMwith84%,89%and87%,andtheywerethesamebranchinphylogeneticanalysis.Theidentificationanalyswasofreovirus,wefoundthatviralsequenceinBenxicity,LiaoningProvinceannotatedtotheorbivirusfromreoviridae,andsharedthe79%highestidentitywithEubenangeevirusaftertheanalyswas.NinebatsofMyotisricketticarriedtheorbivirusfromreoviridaefromthetwenty-ninebatsinBenxiCity,LiaoningProvincewereacquiredandthepositiveratewas33.3%.Atthesametime,thisreovirusoforbivirusgenuswasfirstdetectedinbatsintheworld.Inaddition,bythespecificityofPCRdetection,weacquiredtwocircovirusesofcircovirusgenusinthebatsofHeilongjiangprovince,onewasdetectedintheforty-threebatsofVespertilioorientalisinAchengdistrictofHarbincityinHeilongjiangProvince,andpositiveratewas4.7%.TheotheronewasdetectedintheninebatsofVespertilioorientalisinSaertudistrictofDaqingcityinHeilongjiangProvince,andpositiveratewas11.1%.WeacquiredthetwobatsofMurinaleucogastercarriedtheparamyxovirusofRubulavirusgenusfromthefortybatsinTonghuaCity,JilinProvince,andthepositiveratewas5%.WealsoacquiredtheeightbatsofRhinolophusferrumequinumcarriedthebunyavirus(Phlebovirus)fromthetwenty-ninebatsinTonghuaCity,JilinProvince,andthepositiveratewas27.6%.TwoX coronavirusesweredetectedinTonghuaCity,JilinProvince,onecoronaviruswasdetectedinthebatsofRhinolophusferrumequinumandthememberofalphacoronavirusandthepositiveratewas2.5%.OtherswasdetectedinthebatsofMurinaleucogasterandthememberofbetacoronavirusandthepositiveratewas3.5%.Weselectedthecircovirus,bunyavirus,paramyxovirusandcoronavirustofurtherresearchinviewoftheaboveidentificationresults.Weacquiredthe2117ntand2113ntgenomesequenceswhichwerefirstlyfoundinnotheastChina,andfoundastemloopstructureintheoriginofreplicationaftergenomepredictionexistintwocircovirusesandstructureofpoly(T)alsoexistintwocircoviruses,andfoundthatthecircoviruswegothadthehighestidentityandthesamebranchinphylogeneticanalysiswithfoxcircovirusofVS7100003,theywereallthememberofcircovirus.WefoundthatthesequncesofbatbunyavirusweacquirednotonlythenucleotidesequencebutaminoacidsequencewashighestidentitywithbatbunyavirusofRp-BunyaV/Shaanxi2011,whichwasthefirstlyfoundinnortheastChina.Fortheresearchofbatparamyxovirus,wegot5318ntgenomicsequencewhichwasusedtotheanalysis,andwefounditwasthehighestidentityandthesamebranchwithhumanparainfluenzavirustype4,andalsothememberofrubulavirus,whichwasfirstlyfoundinnortheastChina.Twocoronavirusesweredetected,andthecompletesequenceswerealsoacquired.WefoundthatbatcoronavirusofJTAC2wasthehighestidentityandthesamebranchwithbatcoronaviruofNeixiang-14,theywereallthememberofalphcoronavirus.OthersofJTMC15wasthehighestidentityandthesamebranchwithbatcoronaviruofJL2012,theywereallthememberofbetacoronavirus.However,wealsofoundthatthisbatcoronavirusofJTMC15waslackofcompletegeneof8gene,whichwastheoutofordinary.Thisstudyfirstlyusedtheviralmegagenomicanalysistocomprehensivelysurveyvirusesbatscarried,andalargenumberofnovelbatviruseswerediscovered,andtwelvevertebrateviruseswereidentifiedincludeastrovirus,parvovirus,orbivirus,picornavirus,vesiculovirus,circovirus,bunyavirus,paramyxovirus,coronavirusandsoon.Fourvirusescontaincircovirus,bunyavirus,paramyxovirus,coronaviruswereusedtofurtherlyanalyze,andthecompletesequencesofcircovirusandcoronaviruswereacquired.ManyviruseswerefirstlyfoundinthreenortheasternprovincesofChina,suchasastrovirus,parvovirus,picornavirus,vesiculovirus,circovirus,bunyavirus,paramyxovirus,alphcoronavirusandsoon.Inadition,itreflectedtheadvantageofviralXI megagenomicanalysisithatwecouldfindthevirusesinsomebatsbytheviralsequenceofannotation.Andviralmegagenomicplayedapowerfultooltofindthenovelviruses.Theseviruseswasenrichedinthedatabaseofbatviruses,andwasprovidedthebasetoknowthesituationthatbatscarriedthevirusesandthediversityofbatviruses,eventoevaluatethethreatstopublichealth.Atthesametime,wealsoacquiredthedataofbathabitatwhichprovidedthebascidataforthelaterunderstandingbathabitatenvironment.Keywords:ThreenortheasternprovincesofChina,Batvirus,Viralmetagenomicanalysis,Viralidentification.XII 前言蝙蝠属于翼手目，是一种会飞翔的哺乳动物，栖息环境具有多样性，与人类接触比较密切，又是重要的病毒储存库，能携带大量的病毒，包括汉坦病毒、丝状病毒、博卡病毒、冠状病毒等病毒，是一些新发的人兽共患病病毒重要来源[1-4]。蝙蝠能携带病毒，可能与蝙蝠自身特殊的生理机能有关，比如能够冬眠，一些病毒能够伴随蝙蝠的冬眠而存在；特有的免疫系统，很多病毒存在蝙蝠体内并不能引起蝙蝠发病，也是携带传播病毒的重要因素；具有迁徙性，跨区域迁徙，也能将病毒跨区域传播，蝙蝠也有可能通过食物链、粪便及水源等途径，将携带的病毒传染给人与动物，从而引发新发和再发传染病流行的风险[3-7]。除了蝙蝠自身条件外，部分国家地区有食用蝙蝠的习惯，在捕捉及处理的过程中，增加了蝙蝠与人类的接触，很容易增加蝙蝠与人类接触的机会，能够将蝙蝠内的烈性传染病毒传播给人或家畜。同样，由于人类活动增加，导致了蝙蝠栖息环境遭到破坏，也会增加人与蝙蝠的接触，引发一些烈性传染病的发生。因此，蝙蝠在新发传染病流行中，具有十分重要的作用。尤其是当前新发传染病流行情况越来越复杂，难防难控的形势也比较严峻。这也引起了广泛的关注，对蝙蝠携带病毒情况的研究也越来越多。通过有效的监控蝙蝠携带病毒组情况以及有效的预测、预警，以应对蝙蝠源病毒引起的新发或再发传染性疾病。随着第二代测序技术的发展，蝙蝠病毒的发掘工作有了巨大的进展，基于第二代测序的病毒宏基因组学分析方法成功地应用在蝙蝠病毒上，大大提高了对新型蝙蝠病毒的发掘工作效率。尤其是在2006年前，蝙蝠病毒的数量仅有60多种病毒，但在病毒宏基因组学技术引入后，新发现的蝙蝠病毒现已至少有一百多种，并且其数量还会逐年增多[3,8]。在我国，张海林于1986年首次在云南的棕果蝠的脑组织中分离出基孔肯雅病毒[9]，之后我国蝙蝠病毒的发掘工作发展比较迅速，比如在蝙蝠病毒数据库中，已有17种蝙蝠博卡细小病毒被发现，其中15种新型博卡细小病毒由我国科研人员完成检测。另外，在这些蝙蝠病毒中，呈现了广泛的地域分布，不同地域蝙蝠病毒有所不同并且同源性也与我国其他地方存在很大不同[8,10]。在我国，辽宁省、吉林省和黑龙江省三省地广人稀，又是非典型的温带季风气候，温暖季节比较短，寒冷季节比较漫长。东北三省的地形也较复杂，黑龙江省以北有小兴安岭、以西有大兴安岭和东北三省东部分散着长白山山系，松花江、乌苏里江、辽河和图们江等河流环绕，也导致了蝙蝠分布不均，甚至1 一些地方没有蝙蝠栖息，蝙蝠的种类偏少，缺乏系统的蝙蝠资源数据。辽宁省、吉林省和黑龙江省这三省又处于我国东北地区的边境线，使得跨境疾病传播的风险持续增加。关于我国东北地区蝙蝠携带病毒的数据缺乏，仅发现了蝙蝠伊库特病毒（Irkutvirus，狂犬病毒属成员）、博卡病毒和冠状病毒[10,11]，也就造成了病毒流行本底情况不清楚。因而系统全面调查我国东北三省蝙蝠携带病毒的自然本底和遗传多态性对于填补东北地区蝙蝠病毒的空白具有重要的意义。本研究主要分两个部分。第一部分主要是对东北三省蝙蝠进行采集，并使用实验室已建立的病毒宏基因组学方法对蝙蝠样品进行研究，以期望获得东北地区蝙蝠携带病毒情况。第二部分主要是基于第一部分的病毒宏基因组学病毒序列注释信息，对有意义的病毒深入研究。2 第一章东北三省蝙蝠病毒宏基因组学研究辽宁省、吉林省和黑龙江省三省处在我国东北地区的边境线上，东面与朝鲜、西面与蒙古以及北面与俄罗斯接壤，与日本和韩国隔海相望，具有重要的战略地位。气候为温带季风气候，东北三省有水绕山环，即大、小兴安岭和长白山等山系，辽河、乌苏里江、松花江和图们江等河流环绕。蝙蝠携带病毒的数据比较少，仅有在辽宁省蝙蝠内检测到博卡病毒以及在吉林省蝙蝠体内检测到了冠状病毒和狂犬病病毒[10,11]。本研究首先对东北三省栖息蝙蝠的自然状态，如种类、数量、地点等，进行科学考察；在获得东北三省蝙蝠生态学数据的基础上，设置蝙蝠病毒监测点，在每个点进行蝙蝠样品的采集，然后对样品进行本实验室建立的病毒宏基因组学分析，以获得东北三省蝙蝠病毒组的基本数据，了解东北三省蝙蝠病毒生态学情况。1.1材料1.1.1蝙蝠样本蝙蝠样本的采集时间主要在2013年和2014年完成。在辽宁省的抚顺市和本溪市，吉林省的吉林市、延边朝鲜族自治州、白山市、通化市、辽源市以及黑龙江省的哈尔滨市、佳木斯市、伊春市、大庆市、绥化市、鸡西市、牡丹江市、七台河市和绥芬河市等16个市内进行采集，共采集了204只蝙蝠。蝙蝠采样具有地域性和蝙蝠种类的随机性、代表性。依据蝙蝠栖息的环境如树上、屋檐下和洞内等进行采集，优先考虑蝙蝠数量比较多的栖息洞。所采集的蝙蝠，均为健康状态，无病态。所有蝙蝠均已经过安乐死后，放入含有冰袋的保温箱运至本实验室。蝙蝠采样的地理分布图如图1.1所示；蝙蝠采集信息如表1.1所示。3 图1.1东北三省蝙蝠生态实地考察点（所有的圆点）和蝙蝠病毒监测点（红色实心圆点）。Figure1.1TheinvestigationofbatecologysitesinthreenortheastprovincesofChinabyallcircleandthedetectionsitesofbatvirusesbyfilledredcircle.4 表1.1东北三省蝙蝠采样信息Table1.1SpeciesandlocationinformationofbatsamplinginthreenortheastprovincesofChina菊头蝠科蝙蝠科菊头蝠属鼠耳蝠属管鼻蝠属蝙蝠属采样地点蝙蝠种类马铁菊头蝠大足鼠耳蝠白腹管鼻蝠东方蝙蝠总数辽宁抚顺市顺城区11本溪市溪湖区66南芬区44本溪县4913恒仁县22931吉林白山市江源区11通化市集安市2727通化县294069黑龙江哈尔滨市阿城区4343大庆市萨尔图区99总数476540522045 1.1.2主要试剂及耗材试剂：反转录酶（ReverseTranscriptaseM-MLV）、RNA酶抑制剂（RibonucleaseInhibitor）、dNTPMixture、随机引物（RandomPrimer-6mer）、Oligod(T)15primers、无RNA酶水（RNase-freeWater）、RNAisoPlus、TaKaRaExTaq、TaKaRaLATaq、DL2000DNAMarker、pMD18-TVector、大片段DNA扩增酶（KlenowFragment）、RibonucleaseH、RecombinantDNaseI（RNase-free）、RibonucleaseA（RNaseA）、碱性磷酸酶（shrimpalkalinephosphatase）和核酸外切酶（exonucleaseI）购自中国大连宝生物（TaKaRa）公司；RNA提取试剂盒（RneasyMiNiKit）购自德国QIAGEN公司；DNA提取试剂盒（TIANampGenomicDNAKit）、TaqPCRMasterMix预混液购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖（BiowestAgarose）购自西班牙Biowest公司；核酸染料（GelRed）购自美国Biotium公司；引物合成及普通样品测序是由吉林省库美生物科技有限公司完成；病毒宏基因组学测序及生物信息学分析是由深圳华大科技有限公司完成。耗材：0.2mLPCR管购自美国Axygen公司；0.45μM和0.22μM孔径的针头滤器购自美国Millipore公司。1.1.3实验仪器玻璃组织研磨器购自江苏海门市玻璃制品厂；ND-1000型核酸蛋白检测仪、生物安全柜购自美国Thermo公司；PCR扩增仪购自美国Bid-Rad公司；凝胶成像系统购自德国莱比信公司；电泳仪购自上海天能科技有限公司；电泳槽购自北京六一公司；艾本德高速离心机购自德国eppendorf公司；干式恒温金属浴购自北京天根生化科技有限公司。1.1.4生物信息学软件引物设计：IDTPrimerTool（http://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index）；序列BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；ORF查找（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）；多序列比对软件：ClustalX2系统进化分析软件：MEGA6.06；6 序列拼接软件：VectorNTI11.5.1。1.2方法1.2.1蝙蝠种类鉴定采集的蝙蝠低温储存并运送到实验室后，先经过东北师范大学生态学院的专家进行形态学鉴定；对不确定种类的蝙蝠，使用蝙蝠细胞色素b基因进行鉴定。具体操作方法如下：1.2.1.1提取DNA取蝙蝠肌肉组织，约50mg，放入玻璃研磨器中，加入500μl的SM研磨缓冲液进行研磨。10,000×g离心5min，取沉淀。使用DNA提取试剂盒并按照操作说明书提取DNA。1.2.1.2PCR检测检测蝙蝠种类的引物序列见附件中，反应体系如表1.2：反应条件为94℃5min；（94℃30sec；56℃1min；72℃1min）共35个循环；72℃10min；4℃保存。反应产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统下观察电泳结果，将产物送至测序公司测序分析。将测序结果在NCBI的BLAST比对，结果中同源性最高的基因组信息所对应的蝙蝠种类即为蝙蝠种类。表1.2蝙蝠种类鉴定的PCR反应体系Table1.2ThecompositionofPCRamplificationtoidentifythebatspecies组份用量2×TaqPCRMasterMix25μLPrimerS（10pmol/μL）2μLPrimerA（10pmol/μL）2μLDNA模板2μLddH2O补加至50μL7 1.2.2病毒宏基因组学处理依据本实验室建立的病毒宏基因组学样品处理方法进行蝙蝠样品的处理[12]。按照地理位置及蝙蝠种类，将收集的蝙蝠进行分组。依照分组信息进行解剖。小组内，每只蝙蝠（包括蝙蝠肺脏和肠道组织）各取火柴头大小，混在一起。然后加入800μl的SM研磨缓冲液进行研磨。研磨后的液体，在4℃10,000×g离心10min，取上清。使用DNA酶和RNA酶两种核酸酶对上清进行处理，以便去除游离的核酸基因。使用TaKaRaRNAsioPlus结合RNA提取试剂盒提取RNA并测定所提取RNA的质量。将提取的RNA与浓度为100pmol/μl锚定20bp标签序列的6mer随机引物（如：GGTATCGCTGGACACTGGACCNNNNNN）以及ReverseTranscriptaseM-MLV、RibonucleaseInhibitor、dNTPMixture、RNase-freeWater等反转录试剂混合，42℃反应1小时进行反转录，85℃灭活酶。再使用RibonucleaseH去除RNA-DNA杂合链。得到的处理液使用乙醇沉淀法纯化cDNA。将纯化后的cDNA再次加入100pmol/μl锚定20bp标签序列的6mer随机引物及dNTPMixture，在Klenowfragment酶作用下，37℃反应1小时并75℃灭活10min。向反应后的体系中，加入SAP酶和exonucleaseI酶，在37℃反应1小时并75℃灭活10min。取10μl的上述反应液，加入TaKaRaExTaq酶及buffer、dNTPMixture、10pmol/μl对应的锚定序列引物（如：GGTATCGCTGGACACTGGACC）以及ddH2O共50μl体系，使用SISPA方法扩增94℃3min；（94℃30sec，55℃30sec，72℃1min）扩增30个循环；72℃10min，再使用乙醇沉淀法纯化DNA并测质量。1.2.3病毒宏基因组学测序将纯化后产物，送深圳华大科技有限公司测序，在Solexa平台上高通量测序分析。依据边合成边测序方法，获得大量原始的读长（reads）数据，再通过处理得到大于100bp的序列和SOAPdenove软件进行拼接成重叠序列（contig）。再使用BLASTn和BLASTx两种比对方式对序列进行注释，去除非病毒相关序列和E值小于10e-5的序列，并进行筛选及分析。1.2.4病毒验证1.2.4.1蝙蝠病毒检测引物设计依据病毒宏基因组学病毒序列注释信息，先拼接再BLAST比对，下载比对结果中同源性最高的几条序列以及对应最新版ICTV分类报告中病毒属的病毒基因。使用MEGA6.06软件进行多序列比对，找出比较保守的区域，设计检测引物。8 1.2.4.2蝙蝠样品研磨及核酸消化依据锚定标签信息，找出含注释信息的蝙蝠样品所在的组。取火柴头大小的样品，加入500μl的SM研磨缓冲液于玻璃研磨器进行研磨。在4℃条件下，10,000×g离心10min，取上清。为了尽可能减少外源核酸的干扰，本研究先使用RibonucleaseA酶和DNaseI酶进行消化，反应体系见表1.3：表1.3核酸消化反应体系。Table1.3Thecompositionofthereactionofnucleicdigestion.组份用量过滤后的液体130μLRecombinantDNaseI（RNase-free）4μL10×DNaseIbuffer15μLRibonucleaseA工作液1μL反应条件：37℃下反应1小时。1.2.4.3蝙蝠病毒核酸提取及反转录使用RNA提取试剂盒及操作说明提取RNA，并测定一下提取RNA的质量。将提取RNA，加入反转录试剂，反转录反应体系及反应条件如下：表1.4病毒RNA反转录体系Table1.4ThecompositionofviralRNAreversetranscription组份用量RNA模板15μLOligod(T)15primers（50pmol/μL）1μLRandomPrimer-6mer（50pmol/μL）3μL9 反应条件：85℃变性5min，迅速冰浴10min，再加入如下组份：组份用量ReverseTranscriptaseM-MLV（200U/μL）1μLRibonucleaseInhibitor（40U/μL）1μL5×M-MLVBuffer10μLdNTPMixture（10mMeach）3μLRNase-freeWater16μL反应条件：42℃恒温80min，80℃灭活5min,4℃降温5min。1.2.4.4PCR扩增加入稀释的引物、模板及PCR预混液试剂，阴性组ddH2O做阴性对照模版，PCR反应体系见表1.5：表1.5PCR扩增反应体系Table1.5ThecompositionofPCRamplification组份用量2×TaqPCRMasterMix25μLForwardprimer（10pmol/μL）2μLReverseprimer（10pmol/μL）2μLcDNA2μLddH2O19μL反应条件：94℃5min；（94℃30sec；53-60℃1min；72℃1min）共30个循环；72℃10min。退火温度以引物实际的退火温度为准。10 待PCR扩增结束后，1%琼脂糖凝胶电泳130V跑25min，电泳结束后在凝胶成像系统下观察，挑选扩增片段大小一致的扩增产物送去测序公司测序鉴定，以获得扩增产物的序列信息。1.2.4.5扩增片段系统进化分析将测序得到的病毒序列，先比对，再下载比对结果较高的序列。同时，也下载该病毒基因序列对应在ICTV分类报告中所处该属已确定的所有病毒基因序列。使用MEGA6.06软件先进行多序列比对，再使用软件的Phylogeny中的邻间法（Neighbor-Joining）或最大似然法（Maximun-Likelihood），自助法（Bootstrapmethod）为1000进行系统进化分析。1.3结果1.3.1蝙蝠种类鉴定及样品采集信息2013年和2014年间在辽宁省、吉林省和黑龙江省三个省共采集204只蝙蝠样品。3个省16个市中，仅在辽宁省本溪市的溪湖区、南芬区、本溪县、恒仁县和抚顺市的顺城区，吉林省通化市的集安市和通化县和白山市的江源区以及黑龙江省哈尔滨市的阿城区和大庆市的萨尔图区等地方采集到了蝙蝠样品。所采集的蝙蝠，主要为2个科4个属4个种的蝙蝠，即菊头蝠科菊头蝠属的马铁菊头蝠以及蝙蝠科鼠耳蝠属的大足鼠耳蝠、管鼻蝠属的白腹管鼻蝠和蝙蝠属的东方蝙蝠，食性均以食虫为主。其中，在辽宁省本溪市和抚顺市，吉林省白山市的江源区和通化市的通化县均采集到了马铁菊头蝠，但在黑龙江省内没有采集到；在辽宁省的本溪县和恒仁县以及吉林省通化市的集安市采集到了大足鼠耳蝠，其他地方均未采集到；白腹管鼻蝠仅在吉林省通化市通化县采集到；东方蝙蝠也仅仅在黑龙江省内采集到，见表1.1。1.3.2病毒宏基因组学分析结果经过测序分析，得出了Virus-likecontigs。经过分析整理，得出这些contigs注释到了22个病毒科和28个病毒属，病毒统计见表1.6。其中，就包括脊椎动物病毒有16个科20个属、昆虫病毒有6个科6个属以及植物病毒有1个科和2个属。脊椎动物病毒主要有星状病毒科（Astroviridae）的哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus）、布尼亚病毒科（Bunyaviridae）的白蛉热病毒属（Phlebovirus）、圆环病毒科（Circoviridae）的圆环病毒属（Circovirus）、冠状病毒科（Coronaviridae）的α冠状病毒属（Alphacoronavirus）和β冠状病毒属（Betacoronavirus）、黄病毒科（Flaviviridae）的瘟病毒属（Pestivirus）、疱疹病毒科（Herpesviridae）的鼠巨细胞病毒属（Muromegalovirus）、副粘病毒科（Paramyxoviridae）的腮腺炎病11 毒属（Rubulavirus）、细小病毒科（Parvoviridae）的博卡细小病毒属（Bocaparvovirus）和依赖细小病毒属（Dependoparvovirus）、披膜病毒科（Togaviridae）的甲病毒属（Alphavirus）、虹彩病毒科（Iridoviridae）的淋巴囊肿病毒属（Lymphocystivirus）、小RNA病毒科（Picornaviridae）的心病毒属（Cardiovirus）、非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）的非洲猪瘟病毒属（Asfivirus）、痘病毒科（Poxviridae）的禽痘病毒属（Avipoxvirus）、呼肠孤病毒科（Reoviridae）的环状病毒属（Orbivirus）、逆转录病毒科（Retroviridae）的α逆转录病毒属（Alpharetrovirus）、β逆转录病毒属（Betaretrovirus）和γ逆转录病毒属（Gammaretrovirus）、弹状病毒科（Rhabdoviridae）的水泡性病毒属（Vesiculovirus）。本研究使用病毒宏基因组学技术对东北三省采集的蝙蝠进行研究，辽宁省注释到了8个病毒科9个病毒属，其中脊椎动物病毒就有5个病毒科6个病毒属，昆虫病毒有3个病毒科3个病毒属，植物病毒没有注释到。吉林省注释到了8个病毒科9个病毒属，其中脊椎动物病毒就有5个病毒科6个病毒属，昆虫病毒有3个病毒科3个病毒属，植物病毒没有注释到。而黑龙江省注释到了14个病毒科15个病毒属，其中脊椎动物病毒就有10个病毒科11个病毒属，昆虫病毒有2个病毒科2个病毒属和植物病毒有2个病毒科2个病毒属。在上述结果中，细小病毒科（Parvoviridae）的依赖细小病毒属（Dependoparvovirus）均在三个省注释到，其他病毒均呈现出一定的地域性，如仅在辽宁省的蝙蝠中注释到的病毒主要有星状病毒科（Astroviridae）的哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus）、冠状病毒科（Coronaviridae）的α冠状病毒属（Alphacoronavirus）、呼肠孤病毒科（Reoviridae）的环状病毒属（Orbivirus）、弹状病毒科（Rhabdoviridae）的水泡性病毒属（Vesiculovirus）以及3种昆虫病毒；仅在吉林省的蝙蝠中注释到的病毒主要有布尼亚病毒科（Bunyaviridae）的白蛉热病毒属（Phlebovirus）、副粘病毒科（Paramyxoviridae）的腮腺炎病毒属（Rubulavirus）、小RNA病毒科（Picornaviridae）的心病毒属（Cardiovirus）、细小病毒科（Parvoviridae）的博卡细小病毒属（Bocaparvovirus）以及1种昆虫病毒；仅在黑龙江省的蝙蝠中注释到的病毒主要有非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）的非洲猪瘟病毒属（Asfivirus）、圆环病毒科（Circoviridae）的圆环病毒属（Circovirus）、黄病毒科（Flaviviridae）的瘟病毒属（Pestivirus）、疱疹病毒科（Herpesviridae）的鼠巨细胞病毒属（Muromegalovirus）、虹彩病毒科（Iridoviridae）的淋巴囊肿病毒属（Lymphocystivirus）、痘病毒科（Poxviridae）的禽痘病毒属（Avipoxvirus）、呼肠孤病毒科（Reoviridae）、逆转录病毒科（Retroviridae）的α逆转录病毒属（Alpharetrovirus）、β逆转录病毒属（Betaretrovirus）和γ逆转录病毒属（Gammaretrovirus）、披膜病毒科（Togaviridae）的甲病毒属（Alphavirus）以及12 2种植物病毒、2种植物病毒，如表1.6。表1.6东北三省病毒宏基因组学病毒序列注释信息。Table1.6ViraltaxonomyofvirallikecontigsinthreenortheastprovincesofChina.LiaoningJilinHeilongjiangHostViralfamilyViralgenusBG/BN/BJ/BHTJ/TB/JTM/JTADBn=54n=97n=52VertebrateAsfarviridaeAsfivirus√AstroviridaeMamastrovirus√BunyaviridaePhlebovirus√CircoviridaeCircovirus√CoronaviridaeAlphacoronavirus√Betacoronavirus√√FlaviviridaePestivirus√HerpesviridaeMuromegalovirus√IridoviridaeLymphocystivirus√ParamyxoviridaeRubulavirus√ParvoviridaeBocaparvovirus√Dependoparvovirus√√√PicornaviridaeCardiovirus√PoxviridaeAvipoxvirus√ReoviridaeOrbivirus√RetroviridaeBetaretrovirus√Gammaretrovirus√Alpharetrovirus√RhabdoviridaeVesiculovirus√TogaviridaeAlphavirus√InsectBaculoviridaeAlphabaculovirus√DicistroviridaeCripavirus√IflaviridaeIflavirus√√ParvoviridaeAmbidensovirus√PolydnaviridaeBracovirus√TetraviridaeBetatetravirus√√PlantPhycodnaviridaeChlorovirus√Prasinovirus√Total9915注：BG：马铁菊头蝠、BN：马铁菊头蝠、BJ：马铁菊头蝠和鼠耳蝠、BH：大足鼠耳蝠和马铁菊头蝠、TJ：大足鼠耳蝠、TB：马铁菊头蝠、JTM：马铁菊头蝠、JTA：白腹管鼻蝠、DB:东方蝙蝠。红色粗体部分，为本研究已验证的病毒。13 1.3.3病毒序列分析及检测结果病毒宏基因组学结果给出了丰富的病毒信息，本研究重点关注能感染脊椎动物的病毒，因此挑选了星状病毒、水泡性病毒、环状病毒、细小病毒和小RNA病毒等病毒进行分析，对布尼亚病毒、圆环病毒、副粘病毒和冠状病毒进行特异性的PCR/RT-PCR验证分析。1.3.3.1布尼亚病毒布尼亚病毒科（Bunyaviridae）是一种分节段的单股负链的RNA病毒，有正布尼亚病毒属（Orthobunyavirus）、汉坦病毒属（Hantavirus）、内罗病毒属（Nairovirus）、白蛉热病毒属（Phlebovirus）等4个动物病毒属[13,14]。布尼亚病毒科（Bunyaviridae）有多种病毒具有重要的公共卫生学意义，比如裂谷热病毒、汉坦病毒以及克里米亚刚果出血热等病毒，宿主范围广泛，一些可通过虫媒进行传播[13,14]。图1.2布尼亚病毒PCR检测电泳图结果Figure1.2TheresultofPCRdetectionofbunyavirus病毒宏基因组学分析结果显示，在吉林省通化市的马铁菊头蝠中有8条病毒序列注释到了布尼亚病毒科（Bunyaviridae）白蛉热病毒属（Phlebovirus）。经过序列拼接后，组装成了278nt长序列，这株布尼亚病毒记作BtBunV-JTM。通过对这条长序列BLAST比对，发现BtBunV-JTM株布尼亚病毒与我国陕西检测到的Rp-BunyaV/Shaanxi2011株布尼亚病毒[10]有最高同源性，能达到65%。通过设计特异性检测引物，检测引物见附录2，从29只马铁菊头蝠中，检测到有8只14 马铁菊头蝠携带有布尼亚病毒基因，阳性率为27.6%（8/29）。BtBunV-JTM株布尼亚病毒单样筛查电泳图如图1.2，图中Marker为2000bp，所有样品均为肠道组织样品检测，其中样品9、10、11、12、14、15、16、17共8个样品为筛查到的样品。1.3.3.2圆环病毒圆环病毒（Circovirus,CV）是一种环状单股负链的DNA病毒，属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），家猪、野猪、乌鸦、鹦鹉以及鹅等动物均对圆环病毒易感[15-20]。病毒宏基因学结果显示，在黑龙江省哈尔滨市和大庆市的东方蝙蝠中有9条病毒序列注释到了圆环病毒，经过序列拼接，共组装7条序列，最长的可以达到778nt。使用拼接后的序列与数据库比对，发现与美国的JZ98/2014株犬圆环病毒和英国的VS7100003株狐狸圆环病毒[21,22]有最高的同源性。设计特异性PCR检测引物，检测引物见附录2。从黑龙江省哈尔滨市阿城区的43只东方蝙蝠中，检测出2只蝙蝠肠道和肺脏有圆环病毒基因存在，阳性率为4.7%（2/43），病毒株标记为BtCV-AC；另外，在大庆市萨尔图区的9只东方蝙蝠中，检测到了一只蝙蝠肠道和肺脏有圆环病毒基因存在，阳性率为11.1%（1/9），病毒株标记为BtCV-DQ，圆环病毒单样筛查结果如图1.3。在这两株阿城区蝙蝠圆环病毒间的同源性为99.0%，两株阿城区蝙蝠圆环病毒与萨尔图区蝙蝠圆环病毒的同源性分别为96.8%和97.8%。使用扩增片段Blast比对，也均与英国VS7100003株狐狸圆环病毒存在最高同源性。图1.3圆环病毒PCR检测电泳图结果Figure1.3TheresultofPCRdetectionofcircovirus15 1.3.3.3副粘病毒腮腺炎病毒属（Rubulavirus）归属于单股负链病毒目（Mononegavirales）副粘病毒科（Paramyxoviridae）副粘病毒亚科（Paramyxovirinae），有7个病毒种[23-25]。腮腺炎病毒属（Rubulavirus）的自然宿主很多，比如蝙蝠、人、猪等；该属病毒能够引发许多呼吸道系统方面的疾病，比如能够引起儿童呼吸道感染的人副流感病毒2型和4型、流行性腮腺炎的腮腺炎病毒、猪蓝眼病的猪腮腺炎病毒等病毒[24,26-29]。病毒宏基因组学病毒序列中，在吉林省通化市的白腹管鼻蝠中有3条病毒序列注释到了副粘病毒科（Paramyxoviridae）腮腺炎病毒属（Rubulavirus），经过序列拼接，获得了1条301nt长序列，病毒标记为BtPV-JTA。与数据库比对，与日本人副流感病毒M25株[30]具有较高的同源性，能达到79%。下载比对结果前几条得分比较高的序列以及腮腺炎病毒属（Rubulavirus）已确定种的基因序列，结合病毒宏基因组学序列，设计了特异性PCR检测引物，检测引物见附录2。从吉林省通化市的40只白腹管鼻蝠中，检测出2只蝙蝠（肠道和肺脏各2份）含有腮腺炎病毒属（Rubulavirus）病毒基因，阳性率为5%（2/40），副粘病毒单样筛查结果如图1.4。这4份样品基因间的同源性高于99.5%，检测片段均与日本人副流感病毒M25株有最高同源性。图1.4副粘病毒PCR检测电泳图结果Figure1.4TheresultofPCRdetectionofparamyxovirus1.3.3.4冠状病毒冠状病毒是单股正链RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)中冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒亚科（Coronavirinae）。冠状病毒亚科（Coronavirinae）16 有α冠状病毒属（Alphacoronavirus）、β冠状病毒属（Betacoronavirus）、γ冠状病毒属（Gammacoronavirus）和δ冠状病毒（Deltacronavirus）四个病毒属，前两个病毒属的冠状病毒主要感染人、猪、犬蝙蝠等哺乳动物，后两个病毒属的冠状病毒主要感染鸟和水生动物[25,31]。病毒宏基因组学结果中，在辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中有1条和吉林省通化市的马铁菊头蝠中有134条序列注释到了β冠状病毒属（Betacoronavirus），辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中有5条序列注释到α冠状病毒属（Alphacoronavirus）。拼接后，吉林省β冠状病毒有9条序列能够拼接成长序列，经过BLAST比对后，均与我国湖北发现的Rf1株和BtCoV/273/2005株蝙蝠冠状病毒[32,33]具有较高的同源性，能达到99%。辽宁省组的序列不可以通过拼接获得长序列，但序列比对后，发现β冠状病毒属这株病毒序列与我国HKU9-2株蝙蝠冠状病毒[34]具有较高的同源性，而α冠状病毒属的这5条序列均与我国BtCoV/A701/2005株蝙蝠冠状病毒[32]存在较高的同源性，最高能达到79%。依据冠状病毒保守基因区域，设计检测引物，序列见附录2。经过特异性引物筛查，从吉林省通化市白腹管鼻蝠中检测到了α冠状病毒属（Alphacoronavirus）和从吉林通化市马铁菊头蝠中检测到了β冠状病毒属（Betacoronavirus）两个病毒属的冠状病毒基因。在吉林省这两株蝙蝠冠状病毒种，一株是从吉林省通化市的29只马铁菊头蝠检测出一只蝙蝠携带有β冠状病毒属（Betacoronavirus）的冠状病毒基因，阳性率为3.45%(1/29)，病毒标记名为JTMC15。另外一株蝙蝠冠状病毒是从吉林省通化市的40只白腹管鼻蝠中检测出一只α冠状病毒属（Alphacoronavirus）的冠状病毒基因，阳性率为2.5%(1/40)，病毒标记名为JTAC2。1.3.3.5星状病毒星状病毒是一种单链正股RNA病毒，是星状病毒科（Astroviridae）哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus）成员，是一种既能感染猪、奶牛、猫、貂、绵羊等动物，又能够感染人，可以导致人急性胃肠炎疾病，具有重要的公共卫生学意义[35-39]。病毒宏基因组学结果显示，在辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中有7条病毒序列注释哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus），病毒名标记为BtAstVLN。对这7条序列进行拼接，只有4条序列能够拼接成2条序列，最长的可以拼接成258nt（LN258）。对拼接后的2条序列及未拼接的3条序列进行BLAST比对，发现这5条序列分别与本实验室从我国云南省畹町爪哇无尾果蝠17 (Megaeropskusnotei)中检测到蝙蝠星状病毒Mek/YN/hwbc3株、不丹国的MLB1人星状病毒和我国香港食虫蝙蝠星状病毒BatAstVAFCD57株[40,41]三株具有最高的同源性，其中拼接成258nt的长序列与蝙蝠星状病毒Mek/YN/hwbc3株的最高同源性为89%。在这5条序列中，LN258nt序列对应的是RNA-dependentRNApolymerase蛋白基因且最长，使用这段基因以及邻间法（Neighbor-Joining），用MEGA6.06软件构建系统进化分析，如图1.5。辽宁省的BtAstV-LN株星状病毒处于哺乳动物星状病毒属的遗传分支内，与蝙蝠星状病毒Mek/YN/hwbc3株同处一分支，均为哺乳动物星状病毒属成员。图1.5星状病毒的遗传进化分析。本研究蝙蝠星状病毒记为黑四边形，其他蝙蝠星状病毒标记为空四边形。Figure1.5PhylogeneticanalysisofAstV-likecontigs.SequencesofAstV-likecontigsareidentifiedbyfilledquadrangle,withotherbatastrovirusesasopenquadrangle.1.3.3.6水泡性病毒弹状病毒科(Rhabdoviridae)属于单股负链目（Mononegavirales），有短暂热病毒属(Ephemerovirus)、水泡性病毒属（Vesiculovirus）和非毒粒蛋白弹状病毒属(Novirhabdovirus)等11个病毒属，该科宿主范围比较广泛，包括蝙蝠、犬、猫等动物[11,25]。在水泡性病毒属（Vesiculovirus）的病毒中，有能引起印度儿童发生脑炎的金迪普拉病毒（Chandipuravirus）、引起家畜水泡性口炎疾病的水泡性口炎病毒、由节肢动物传播能使人发生感染并能够引起家畜发生水泡性口炎疾病的伊斯法罕病毒（Isfahanvirus）等病毒[42-45]。18 在病毒宏基因组学结果中，在辽宁本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中有153条病毒序列注释到了水泡性病毒属（Vesiculovirus）。对这些病毒序列拼接，共拼接成8条序列，其中最长的为1772nt。对这8条序列比对分析，发现有两条注释到N蛋白基因，一条注释到G蛋白基因，其余均注释到L蛋白基因；并且均与美国蛰伏蝙蝠检测到的TFFN-2013株蝙蝠水泡性病毒[43]存在最高的同源性，其中最长的片段最高同源性为64.3%。使用特异性PCR检测引物，对辽宁省本溪市蝙蝠样品进行检测。从辽宁省本溪市溪湖区6只马铁菊头蝠中检测到2只蝙蝠携带水泡性病毒，阳性率为33.3%；从辽宁省本溪市本溪县4只马铁菊头蝠中检测到1只蝙蝠携带水泡性病毒，阳性率为25.0%；从辽宁省本溪市恒仁县2只马铁菊头蝠中全部检测到水泡性病毒，阳性率为100%。在这些样品中，基因序列间的同源性，均高于99.6%。在水泡性病毒属中的病毒常使用N蛋白基因构建系统进化分析，选用其中一条N基因序列，使用邻间法（Neighbor-joiningmethod）和MEGA6.06软件构建系统进化分析如图1.6。辽宁省的这株水泡性病毒蝙蝠水泡性病毒同处一分支，均为水泡性病毒属成员。图1.6水泡性病毒遗传进化分析。本研究中的水泡性病毒标记为黑四边形，其他蝙蝠水泡性病毒标记为白四边形。Figure1.6PhylogeneticanalysisofBtVSV-likecontigs.Sequencesfromourstudyareidentifiedbyfilledquadrangle,withotherbatvesiculovirusesasopenquadrangle.19 1.3.3.7环状病毒呼肠孤病毒科（Reoviridae）基因组为线性双链RNA病毒，共有10~12个RNA片段，有两个病毒亚科；其中，光滑呼肠孤病毒亚科(Sedoreovirinae)有环状病毒属（Orbivirus）、轮状病毒属（Rotavirus）和Mimoreovirus等6个病毒属，病毒宿主比较广泛，主要有人、羊、猪、马、鸟等[46]。在环状病毒属的病毒中，有一些病毒能够引起人与动物发生重大疾病，比如有引起反刍动物蓝舌病的蓝舌病毒（Bluetonguevirus），非洲马瘟的非洲马瘟病毒（Africanhorsesicknessvirus），具有重要人兽共患的昌吉诺拉病毒（Changuinolavirus）、科里帕塔病毒（Corripartavirus）、大岛病毒（GreatIslandvirus）、奥轮谷病毒（Orungovirus）、云南病毒（Yunnanorbivirus）、马图凯亚病毒（Matucarevirus）以及在蝙蝠内发现的乔巴峡病毒（ChobarGorgevirus）和杰潘纳特病毒（Japanautvirus）等病毒[46-48]。病毒宏基因组学结果中，有4条病毒序列来源于辽宁本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠注释到了环状病毒属（Orbivirus），分别处于片段3、片段4和片段5，这4条病毒序列仅有2条序列能有效拼接成1条长312nt序列，这株环状病毒记作BtOrbV。经过Blast比对，发现均与环状病毒属中的澳大利亚Eubenangeevirus、巴西树懒昌吉诺拉病毒CGLV/BEAR385199株[48]和南非蓝舌病毒S7668株具有最高同源性，分别为79%、81%和79%。特异性PCR检测，从辽宁省本溪市恒仁县的29只大足鼠耳蝠中，检测到4只蝙蝠携带有环状病毒，阳性率为13.8%（4/29）。在环状病毒属（Orbivirus）基因中，通常选用有保守片段3的序列进行系统进化分析，使用邻间法（neighbor-joining）和MEGA6.06软件构建系统进化分析[49]，如图1.7。辽宁省这株环状病毒与环状病毒属病毒均处在同一进化分支。20 图1.7环状病毒遗传进化分析。本研究中的环状病毒标记为黑四边形。Figure1.7PhylogeneticanalysisofBtOrbV-likecontigs.Sequencesfromourstudyareidentifiedbyfilledquadrangle.1.3.3.8蝙蝠细小病毒细小病毒科（Parvoviridae）为单链DNA病毒，有细小病毒亚科(Parvovirinae)和浓病毒亚科(Densovirinae)两个亚科。细小病毒亚科(Parvovirinae)有8个病毒属，即Aveparvovirus、Amdoparvovirus、Bocaparvovirus、Copiparvovirus、Dependoparvovirus、Erythroparvovirus、Protoparvovirus和Tetraparvovirus[50]。博卡细小病毒（Bocaparvovirus）和依赖细小病毒（Dependoparvovirus）能感染猪、鸭、鸟、牛、人以及蝙蝠等多种宿主[50-52]。依据病毒宏基因组学结果，有6条序列注释到了在吉林省通化市通化县的马铁菊头蝠，经过序列拼接，共拼接成3条序列，最长为171nt。经过序列比对，发现有2条序列注释到了博卡病毒NS蛋白区域，另外一条注释到了博卡病毒VP1/VP2蛋白区域，且均与从辽宁省马铁菊头蝠检测到的蝙蝠博卡病毒BtRf-BoV-1/LN2012株具有最高同源性。使用这2条序列设计特异性检测引物。从29只马铁菊头蝠中，检测到19只蝙蝠携带博卡病毒，阳性率为65.5%（19/29）。对21 VP1/VP2蛋白基因进行同源性分析，发现与蝙蝠博卡病毒BtRf-BoV-1/LN2012株同源性为98.6%。通过基因扩增，获得了4893nt长序列，近乎全基因组，并对其进行结构预测，如图1.8。图1.8BtBoV-JL株博卡病毒基因结构Figure1.8GenomeschematicsofbatbocavirusisolateJL.另外，在病毒宏基因组学结果中，在辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠、吉林省通化市的白腹管鼻蝠以及黑龙江省的东方蝙蝠中，均发现有病毒序列注释到细小病毒科依赖细小病毒属蝙蝠腺联病毒YNM株。辽宁省和吉林省共有3695条序列，经过序列拼接，共获得了9条序列，其中序列长度最短的为135nt，最长的为1347nt。对这9条序列进行Blast比对，发现均与我国云南大足鼠耳蝠源YNM株腺联病毒[53]具有最高同源性，其中有1条病毒序列对应的是辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠，与YNM株蝙蝠腺联病毒同源性最高，为84%，病毒名记作BtPV-LN；另外8条病毒序列与YNM株细小病毒最高同源性为89%，病毒标记为BtPV-JL。在黑龙江省的东方蝙蝠中有17条病毒序列注释到了依赖细小病毒属（Dependoparvovirus），经过序列拼接，共获得了7条序列。对这7条序列比对，发现也均与蝙蝠腺联病毒YNM株[53]有最高同源性，病毒名记作BtPV-HLJ。下载最新ICTV分类报告对应细小病毒科的基因序列以及NCBI中具有全基因组序列细小病毒科的蝙蝠病毒，使用MEGA6.06软件进行多序列比对及序列截取。使用博卡病毒结构蛋白以及三株细小病毒结构蛋白（CP/VP蛋白）的氨基酸序列和邻间法（Neighbor-Joiningmethods），用软件MEGA6.06构建系统进化22 图1.9细小病毒科结构蛋白CP/VP氨基酸序列的遗传进化分析。本研究中的23 细小病毒标记为黑四边形，其他蝙蝠细小病毒标记为白四边形。Figure1.9PhylogeneticanalysisofparvoviridaeusingpartialstructuralproteinCP/VPaminoacidsequence.Sequencesfromourstudyareidentifiedbyfilledquadrangle,withotherbatparvovirusesbyopenquadrangle.分析，如图1.9。吉林省这株博卡病毒与我国辽宁省马铁菊头蝠源的博卡病毒处在同一进化分支中，与辽宁省水鼠耳蝠中的博卡病毒不在同一进化分支。BtPV-LN株、BtPV-JL株和BtPV-HLJ株三株细小病毒分别处于不同位置，但均与YNM株细小病毒处在同一进化分支，但都同属于依赖细小病毒属（Dependoparvovirus）成员。对BtPV-LN3株、BtPV-JL10株、BtPV-HLJ1株和YNM株等四株蝙蝠腺联病毒共有序列进行同源性分析，发现BtPV-LN3株与BtPV-HLJ1株细小病毒之间的同源性为94.5%，与BtPV-JL10株细小病毒的同源性为72.0%，与YNM株同源性分别为82.9%；BtPV-HLJ1株与BtPV-JL10株细小病毒同源性为70.7%，与YNM株的同源性为82.3%；BtPV-JL10株与YNM株细小病毒的同源性为75.0%。1.3.3.9蝙蝠心病毒小RNA病毒科（Picornaviridae）属于小RNA病毒目（Picornavirales），为RNA病毒群中最小的群，没有囊膜，是一种单股正链RNA病毒[54]，现有29个病毒属[25]。能够引起重大疾病，比如肠道病毒（Enterovirus）的猪水疱性口炎、柯萨基病毒和脊髓灰质炎病毒，口蹄疫病毒属（Aphthovirus）的口蹄疫病毒等[54]。心病毒属（Cardiovirus）有脑心肌炎病毒，这种病毒可以引起多种哺乳动物、灵长类动物甚至鸟类感染急性传染病，是一种重要的人兽共患病病毒[54-56]。本次病毒宏基因组学病毒序列，有4条序列来自于吉林省通化市和白山市的大足鼠耳蝠和马铁菊头蝠注释到了小RNA病毒科（Picornaviridae）的心病毒属（Cardiovirus），病毒标记为BtPV-TJ-TB。序列拼接后，形成一条长361nt的序列。Blast比对后，发现拼接片段为polyprotein蛋白基因，与刚果蝙蝠（Hipposiderosgigas）内的AfricanbaticavirusAisolatePREDICT-06105病毒同源性最高，为84.2%；与已确定为心病毒属（Cardiovirus）的BoonecardiovirusisolateBCV-1病毒株的同源性紧随其后。设计特异性检测引物，对吉林省通化市和白山市的大足鼠耳蝠和马铁菊头蝠进行检测。从吉林省通化市通化县的大足鼠耳蝠中检测到9只蝙蝠携带有心病毒，阳性率为33.3%（9/27）。下载最高同源性的病毒序列以及ICTV分类报告对24 应小RNA病毒科的基因序列，使用MEGA6.06软件进行多序列比对及序列截取。使用poly蛋白的氨基酸序列和邻间法（Neighbor-Joining）进行系统进化分析，如图1.10。BtPV-TJ-TB株病毒与AfricanbaticavirusAisolatePREDICT-06105病毒均处于同一进化分支，也与心病毒属病毒近缘。图1.10小RNA病毒氨基酸序列的遗传进化分析。本研究中的小RNA病毒标记为黑四边形，其他蝙蝠小RNA病毒标记为白四边形。25 Figure1.10PhylogeneticanalysisofBtPV-likecontigsusingpartialpolyproteinaminoacidsequence.SequencesofBtPV-likecontigsareidentifiedbyfilledquadrangle,withotherbatpicornavirusesasopenquadrangle.1.3.3.10其它脊椎动物病毒在本研究病毒宏基因组学分析结果中，脊椎动物病毒除了以上检测分析结果以外，还有一些大型DNA病毒和RNA病毒。其中，虹彩病毒是一种大型的DNA病毒，直径可以达到240nm，甚至也有达到300nm，其基因组约100~240kb，其宿主主要包括爬行动物、昆虫和鱼类等[57-59]。病毒宏基因组学结果中，黑龙江省有3条序列注释到了淋巴囊肿病毒属（Lymphocystivirus），经过序列比对，结果均为蝙蝠基因组。非洲猪瘟是一种烈性传染病，死亡率高达100%，是OIE规定的A类重大疾病，也是我国规定的Ⅰ类重大疾病[60]。非洲猪瘟病毒属于非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）非洲猪瘟病毒属（Asfivirus），是一种单股双链DNA病毒，其基因组长170kb~190kb且能够编码超过200多种蛋白，生物学特征介于虹彩病毒和痘病毒之间[60,61]。病毒宏基因组学结果中，黑龙江省有2条序列注释到了非洲猪瘟病毒属（Asfivirus），经过Blast比对，均无信息。痘病毒是属于痘病毒科（Poxviridae）一类大型的DNA双链分子，其基因组能达到300kb，能够感染绝大多数的动物和人，许多痘病毒能够感染多种宿主并且还能跨种传播，是一类重大的人兽共患病病原[62-64]。病毒宏基因组学结果中，黑龙江省有2条序列注释到了禽痘病毒属（Avipoxvirus），经过序列比对，均为蝙蝠基因组。巨细胞病毒属于疱疹病毒目（Herpesvirales）疱疹病毒科（Herpesviridae）的鼠巨细胞病毒属（Muromegalovirus），是一种双链DNA病毒，基因组长125~295kb，是一种大型DNA病毒，能够感染鸟类以及人、猪、牛等哺乳动物[65-68]。病毒宏基因组学结果中，黑龙江省有2条序列注释到了鼠巨细胞病毒属（Muromegalovirus），经过序列比对，结果为兔子基因组。瘟病毒（Pestivirus）是黄病毒科（Flaviviridae）成员，是一种具有单股正链RNA病毒，其基因组长12.3kb左右，是黄病毒科中基因组最长的病毒，能够感染猪、牛、羊等动物，是一些引起重大疾病的病因，比如猪瘟病毒、牛病毒性腹泻等[69,70]。病毒宏基因组学结果中，黑龙江省有11条序列注释到了瘟病毒属（Pestivirus），经过序列比对，结果均为蝙蝠基因组。甲病毒是一种单股正链RNA病毒，属于披膜病毒科（Togaviridae）的甲病毒属（Alphavirus），基因组长9.7~11.8kb，具有广泛的宿主，可以感染人、鱼、家畜、禽类等动物。病毒宏基因组学结果中，黑龙江省有1条序列注释到了甲病毒属（Alphavirus），经过序列26 比对，结果均为Ig重链基因。逆转录病毒是一种单股正链RNA病毒，其病毒结构为球形，直径80~100nm，属于逆转录病毒科（Retroviridae）有正反转录亚科（Orthoretrovirinae），能够感染鸟类、哺乳动物。病毒宏基因组学结果中，黑龙江省分别有2条、1条和7条序列注释到了α逆转录病毒属（Alpharetrovirus）、β逆转录病毒属（Betaretrovirus）和γ逆转录病毒属（Gammaretrovirus），经过序列比对，均为蝙蝠基因组。1.4讨论蝙蝠能够携带至少有170种病毒，至少有15个病毒科，60多种人兽共患病病毒，包括汉坦病毒、亨德拉尼帕病毒、埃博拉病毒、冠状病毒、马尔堡病毒等病毒[1-4,71]，能够引发重要的公共卫生学意义，同时也引起了越来越多的科研人员对蝙蝠携带病毒情况及病毒生态多样性的研究。传统的检测方法，对一些新型蝙蝠病毒的检测工作不尽人意，十年前仅从蝙蝠体内检测到有60余种蝙蝠病毒，而Donaldson等首次使用基于第二代高通量测序的病毒宏基因组学分析对北美地区蝙蝠进行分析，发现了一些蝙蝠病毒，其中就包括了新型冠状病毒和其他昆虫病毒、植物病毒等[72,73]。随着病毒宏基因组学技术的引入，越来越多的蝙蝠病毒被发现，并且其数量还在逐年递增。在我国，Ge等和Wu等以及本实验室先后对我国及周边多个地方蝙蝠进行采集，并使用了病毒宏基因学分析手段从蝙蝠体内发现了许多蝙蝠病毒，比如圆环病毒、腺病毒、布尼亚病毒、丝状病毒和冠状病毒等，获得了大量的病毒数据[10,12,74,75]。在本研究中，使用病毒宏基因组学方法首次对我国东北地区蝙蝠携带病毒情况进行全面研究。在2013年和2014年间，对黑龙江省、吉林省和辽宁省三个省16个市进行采样，但只在辽宁省本溪市和抚顺市、吉林省的通化市和白山市以及黑龙江省的哈尔滨市和大庆市采集到了蝙蝠样品，有204只蝙蝠，其他地方均没有采集到蝙蝠样品，蝙蝠样品采集信息见表1.1，图1.1。可能是由于东北地区的地理位置具有特殊性、复杂性，有水绕山环，即西部、北部和西北处有大、小兴安岭山系以及东部有长白山山系，辽河、乌苏里江、松花江和鸭绿江等河流环绕。东北地区的气候又是非典型的温带性季风气候，冬季严寒漫长，夏季较短气温不高等，也使得东北地区蝙蝠种类及数量比较少，远不如南方地区蝙蝠种类及数量的庞大。目前在我国东北三省仅发现有2个蝙蝠科8个蝙蝠属21种蝙蝠，仅占我国蝙蝠种类总数的近1/6[76,77]。而采集到蝙蝠的两个地方，一个地方主要集中在辽宁省和吉林省的东部地区，这个地区主要是长白山系，有适合蝙蝠栖息的环境，使得一些蝙蝠在这里栖息；另外一个地方是在黑龙江省偏南地方采集到的，这个地方主要分布着完达山、张广才岭以及老爷岭，形成天然的地理环境。27 对采集到的蝙蝠样品，使用本实验室已建立的病毒宏基因学分析方法[12]，获得了大量的数据。依据病毒宏基因组学病毒序列注释信息，注释到了23个病毒科和27个病毒属。另外，依据病毒宏基因组学中病毒序列注释信息，可以看出蝙蝠携带病毒具有地域之间的差异，比如有8个病毒科9个病毒属仅在辽宁省的蝙蝠中有注释，有8个病毒科8个病毒属仅在吉林省的蝙蝠中有注释，而黑龙江省则有15个病毒科15个病毒属。这种现象可能与东北三省地理信息有关，黑龙江省中间以伊勒呼里山为连接，东南部有东北部到西南走向的张广才岭、老爷岭和完达山，地理相隔也造成了蝙蝠种类不一致。黑龙江省的蝙蝠主要为东方蝙蝠，辽宁省的蝙蝠主要是马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠，吉林的有马铁菊头蝠、大足鼠耳蝠和白腹管鼻蝠，不同蝙蝠携带的病毒可能也就不一样，而且每个省所检测到的病毒也不相同，也就形成了自然隔绝现象。在这些脊椎动物病毒中，星状病毒、水泡性病毒、细小病毒、小RNA病毒、环状病毒等病毒进行了验证分析，均与病毒宏基因组学结果吻合。在这些病毒当中，水泡性病毒具有广泛的致病性，能够使犬、猫、人等都患病，而验证的这株水泡性病毒属的水泡性病毒是国内首次从蝙蝠内检测到的。在辽宁省本溪市的蝙蝠携带水泡性病毒的阳性率为25.0~100%，由于样品量较少，数据真实性存在偏差，未来将会对本溪市的蝙蝠进行持续性追踪与检测。水泡性病毒序列也与国内现有的水泡性病毒存在较低的同源性，但与美国源的水泡性病毒存在较高同源性，或许随着国内更多的水泡性病毒被发掘，水泡性病毒的多样性也越发明显。现如今，还未有研究数据表明蝙蝠能够携带环状病毒，而在本研究中，从辽宁本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中发现有环状病毒的病毒序列，并且这株环状病毒与现有的病毒存在较高的同源性，且与现有的环状病毒处在同一进化分支中，预示着这株环状病毒可能是一株新型的环状病毒。同时，这株环状病毒应该是国内首次在蝙蝠中检测到的。对于星状病毒，从蝙蝠体内现已检测到了大量的星状病毒，但在这些星状病毒病毒序列中存在了基因组遗传的多样性，本次验证的这株星状病毒与我国香港的蝙蝠星状病毒存在最高的同源性，具有76%。或许这两株星状病毒存在一定关系，尤其是在蝙蝠大迁徙的情况下，但他们均为食虫类蝙蝠，进一步说明了我国不同地域不同蝙蝠存在不同的蝙蝠星状病毒。东北三省中的这三株细小病毒，可能均来源于同一株细小病毒，随蝙蝠分布处于不同地域，以及不同蝙蝠种类，蝙蝠携带的腺联病毒为了适应生存发生了不同方向的基因分子进化。本研究在吉林省通化市通化蝙蝠检测到了一株蝙蝠博卡病毒，这株博卡病毒与我国辽宁省马铁菊头蝠体内检测到的BtRf-BoV-1/LN2012株蝙蝠博卡病毒[10]具有最高同源性，能够达到98%，在ICTV分类学地位上，属于同一个病毒种。另外，本研究中BtBoV-JL株博卡病毒与两株辽宁省水鼠耳蝠中博卡病毒[10]在系统进化28 分析中不在同一分支。从地理位置上，通化县又靠近辽宁省本溪市；从蝙蝠种类上，均为马铁菊头蝠；从采集时间上讲，两株蝙蝠博卡病毒采集时间不同，相差一年，BtRf-BoV-1/LN2012株蝙蝠博卡病毒所对应的样品采集日期为2012年，本研究中博卡病毒对应的样品采集时间为2013年。从一定角度上讲，本研究检测到的博卡病毒与辽宁省这十株蝙蝠博卡病毒呈现出了蝙蝠种属差异，即不同种类蝙蝠携带的博卡病毒种不同，同一种蝙蝠种在地理位置近缘地带携带的博卡病毒可能会是同一个病毒种，也有可能博卡病毒会随着时间的变化，遗传信息也会发生分子进化。另外，也通过了特异性PCR检测手段对水泡性病毒、环状病毒、心病毒、博卡病毒、布尼亚病毒、圆环病毒、副粘病毒以及冠状病毒等病毒进行了特异性筛查，从东北三省蝙蝠中检测出了蝙蝠能够携带这些病毒，也验证了这些病毒真实存在的，如表1.7。通过对这些病毒验证分析，说明了病毒宏基因组学分析的灵敏性及准确性，只要有病毒基因存在，能找出对应病毒所在蝙蝠样品中，这也说明了病毒宏基因组学在发现新型病毒的工作中，起到了突破性的作用。本研究中，病毒宏基因组学结果还有一些病毒，比如虹彩病毒科（Iridoviridae）的淋巴囊肿病毒属（Lymphocystivirus）、非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）的非洲猪瘟病毒属（Asfivirus）、痘病毒科（Poxviridae）的禽痘病毒属（Avipoxvirus）、疱疹病毒科（Herpesviridae）的鼠巨细胞病毒属（Muromegalovirus）、黄病毒科（Flaviviridae）的瘟病毒属（Pestivirus）、逆转录病毒科（Retroviridae）的α逆转录病毒属（Alpharetrovirus）、β逆转录病毒属（Betaretrovirus）和γ逆转录病毒属（Gammaretrovirus）和披膜病毒科（Togaviridae）的甲病毒属（Alphavirus）等7个病毒科9个病毒属。在这些病毒中，通过序列拼接比对，结果均不是病毒基因序列。为了能够在宿主内进行增殖与复制，病毒基因会将自己部分基因整合到宿主基因中，形成与宿主基因同源且不易被免疫系统捕获，从而达到复制的目的[64,68,78-84]，而甲病毒不能通过这种方式整合到宿主基因上，但可以与宿主转录后的基因相结合，在疫苗的研制中，就是利用甲病毒这种特性，以甲病毒为载体，来开发抗肿瘤药物[85-87]。高通量测序结束后，得到了大量的contigs，在后期生物信息学分析中，首先是将这些contigs与病毒核酸数据库进行比对分析，将这些29 表1.7东北三省蝙蝠病毒检测结果Table1.7DetectionresultsofbatvirusesinthreenortheastprovincesofChina辽宁省吉林省黑龙江省本溪市通化市哈尔滨市大庆市溪湖区本溪县恒仁县集安市通化县阿城区萨尔图区马铁菊头蝠马铁菊头蝠大足鼠耳蝠马铁菊头蝠大足鼠耳蝠马铁菊头蝠白腹管鼻蝠东方蝙蝠东方蝙蝠病毒病毒株n=6n=4n=29n=2n=27n=29n=40n=43n=9博卡病毒BtBoV-JL19（65.5%）水泡性病毒BtVSV-LN2（33.3%）1（25.0%）2（100%）心病毒BtPV-TJTB9（33.3%）环状病毒BtOrbV-LN14（13.8%）圆环病毒BtCV-AC2（4.7%）BtCV-DQ1（11.1%）布尼亚病毒BtBunV-JTM8（27.6%）副粘病毒BtPV-JTA2（5.0%）冠状病毒BtCoV-JTMC151（3.5%）BtCoV-JTAC21（2.5%）30 具有整合宿主基因且与宿主基因具有高同源性的序列，就注释到了相应的病毒。同样在哺乳动物基因库中，也能找到这些病毒信息的身影。另外，我们对这些疑似病毒进行后续分析时，其序列是使用了nr/nt（所有基因组数据库）进行序列比对，这些基因组序列就比对到了宿主相关基因，比如宿主基因组、Ig基因等。本研究主要关注的是脊椎动物病毒，因为很多脊椎动物病毒都是人兽共患的病毒，既能感染人也能感染动物，比如狂犬病病毒、冠状病毒、布尼亚病毒等，但从蝙蝠体内检测到很多蝙蝠病毒的病毒基因组与已确定感染人与动物的病毒基因组学之间有很大的遗传差异，是否具有感染人与动物的潜力，很大程度都是未知，这对防控重大疾病的发生有着重要的公共卫生学意义。因而对东北地区蝙蝠病毒宏基因组学注释到这么多病毒中，主要针对脊椎动物病毒进行研究。除了脊椎动物病毒以外还有昆虫病毒、植物病毒，体现了蝙蝠体内携带的病毒种类的多样性。这些病毒可能也与所采集的蝙蝠食性有关系，它们均为食虫性蝙蝠。昆虫病毒就由蝙蝠食入而残存在蝙蝠体内，而植物病毒也有可能是昆虫病毒摄入的。综上所述，首次使用病毒宏基因组学分析方法对东北地区蝙蝠进行全面研究，得到了大量的病毒信息，以及一些具有公共卫生学意义的病毒，比如布尼亚病毒、副粘病毒和冠状病毒等。获得了东北三省蝙蝠携带病毒的本底数据，也进一步丰富了蝙蝠病毒数据库，系统获得了东北三省蝙蝠携带病毒组的情况并了解了蝙蝠病毒的多样性，为评估东北三省蝙蝠病毒在公共卫生的威胁提供了基础数据。31 32 第二章新型蝙蝠病毒的鉴定我国东北三省采集到的蝙蝠，通过病毒宏基因组学分析结果，发现病毒序列注释到了脊椎动物病毒有16个科22个属，在第一章中主要针对了这些脊椎动物病毒进行了验证分析。在本章中，主要针对布尼亚病毒、圆环病毒、冠状病毒和副粘病毒这四种病毒的研究。通过病毒分离、全基因组学分析以及生物信息学进行研究。2.1材料2.1.1蝙蝠样品已通过特异性PCR检测为病毒阳性的蝙蝠组织样品。2.1.2试剂及耗材试剂：TaKaRaLATaq、DL2000DNAMarker、pMD18-TVector、反转录酶（ReverseTranscriptaseM-MLV）、RNA酶抑制剂（RibonucleaseInhibitor）、dNTPMixture、随机引物（RandomPrimer-6mer）、Oligod(T)15primers、无RNA酶水（RNase-freeWater）、3’-FullRACECoreSetVer.2.0和5’-FullRACEKit购自大连宝生物（TaKaRa）公司；RNA提取试剂盒（RneasyMiNiKit）购自德国QIAGEN公司；DNA提取试剂盒（TIANampGenomicDNAKit）、TaqPCRMasterMix预混液和DH5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖（BiowestAgarose）购自西班牙Biowest公司；核酸染料（GelRed）购自美国Biotium公司；AxyPrep质粒DNA小量试剂盒、AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；细胞培养类：双抗（青霉素和链霉素）购自美国PAA公司；胎牛血清、MEM培养液、DMEM培养液、0.25%胰酶购自美国Corning公司；引物合成及普通样品测序是由吉林省库美生物科技有限公司完成；耗材：1.5mL离心管、0.2mLPCR管购自美国Axygen公司；细胞培养瓶、50mL离心管购自美国CORNING公司。2.1.3细胞系BHK-21细胞、Vero细胞、Vero-E6细胞和Marc145细胞等四种细胞均由本实验室保存。33 2.1.4实验仪器倒置光学显微镜购自日本Olympus公司；玻璃组织研磨器购自江苏海门市玻璃制品厂；CO2恒温培养箱、核酸蛋白检测仪（NanoDrop®ND-1000）、生物安全II级操作台购自美国Thermo公司；台式高速离心机购自德国eppendorf公司；PCR扩增仪购自美国Bid-Rad公司；凝胶成像系统购自德国莱比信公司；电泳仪购自上海天能科技有限公司；电泳槽购自北京六一公司；干式恒温金属浴购自北京天根生化科技有限公司。2.1.5生物信息学软件引物设计：IDTPrimerQuestTool（http://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index）；基本局部比对工具BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；ORF查找（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）；核酸结构预测：RNAstructure（http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/）；系统进化分析软件：MEGA6.06；多序列比对软件：ClustalX2；序列拼接软件：VectorNTI11.5.1；序列绘图及同源性比较：DNAstar软件包。2.2方法2.2.1病毒核酸提取2.2.1.1DNA病毒的核酸提取将蝙蝠组织样品从-80℃冰箱取出，立即放置于冰中，取火柴头大小，放入玻璃研磨器中，其余样品放回。加入500μL的SMbuffer进行研磨。10,000×g离心10min，取上清。使用DNA提取试剂盒（TIANampGenomicDNAKit）提取DNA，操作步骤见试剂盒说明书。2.2.1.2病毒RNA提取及反转录参见1.2.4.3蝙蝠病毒核酸提取及反转录。2.2.2引物设计依据病毒宏基因组学测序给出的参考基因，BLAST比对，下载与该条序列注释相同或同属的基因序列以及ICTV分类报告中对应同属的基因序列，使用ClustalX2软件进行多序列比对，选取保守区域设计引物。保守区域设计的引物34 无法检测出病毒基因时，可以选取保守区域基因其他位置。保守区域设计的引物无法检测病毒基因时，也可以尝试选用病毒宏基因组学测序给出的基因序列。先对基因序列进行拼接，在此基础上进行设计引物，同时为了提高扩增片段的特异性扩增效率，依据巢式PCR扩增法要求设计套式引物。对于GenomeWalking扩增引物的设计，依据已知的基因序列设计specificprimer引物。2.2.3蝙蝠样品检测针对圆环病毒、布尼亚病毒、副粘病毒以及冠状病毒，依据病毒宏基因组学测序结果，初步找出这四种蝙蝠病毒对应蝙蝠样品组情况。使用特异性检测引物对这四种蝙蝠病毒所在组混样（五混一）的DNA/cDNA进行PCR扩增检测。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带大小与预期扩增片段大小一致，送去库美生物科技有限公司进行测序鉴定。使用特异性检测引物，对阳性混样组的单样样品进行筛查，并进行测序鉴定。计算蝙蝠感染率。2.2.4病毒全基因组扩增及测序2.2.4.1普通PCR扩增方法依据设计的引物，PCR扩增，扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带大小应与预期扩增片段大小一致。如果出现条带不是单一的，需要使用宽孔的胶重新进行电泳，在紫外光线下对样品切胶，需要使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒对凝胶回收，再使用核酸蛋白检测仪测量回收的DNA质量，然后送去测序公司测序鉴定。对于圆环病毒，进行全基因组扩增时，在已获得基因基础上，需要使用反向扩增来获得全基因序列。2.2.4.2染色体步移法扩增在RNA病毒扩增中，遇到比较难扩增的基因区域，采用了染色体步移法（genomewalking）扩增方法。Arnold等[88]将Bubble-PCR方法进行拓展，建立染色体步移技术，后由Liu等[89,90]尝试设计了特殊的随机简并引物（arbitrarydegenerateprimer）。依靠特异性PCR扩增引物和特殊设计的随机简并引物，结合TaKaRaLATaq酶进行扩增。具体原理如图2.1。35 图2.1染色体步移法扩增原理。Figure2.1Mechanismofgenomewalking.染色体步移法具体方法步骤如下：1）、依据前期RNA提取完之后，测量RNA的质量，确定cDNA模板的使用量。微生物常使用10~100ng的模板量。病毒总RNA提取后，测得浓度都挺高的，模板量使用1μL能够扩增出条带。2）、引物准备本实验中用到的特异性引物SPPrimer的长度通常为20~26nt；退火温度设计在60℃~69℃之间；GC含量为45~55%间；两条特异性引物间距离为60~100bp；稀释浓度为10pmol/μL，而经过特殊设计的随机简并引物ADPrimer（arbitrarydegenerateprimer）应稀释的浓度为100pmol/μL。在扩增时，需要进行三次PCR扩增，三次扩增中，SP1Primer、SP2Primer和SP3Primer三种依次进行类似于半巢式PCR（semi-nestedPCR）扩增方法三次扩增。AD136 Primer、AD2Primer、AD3Primer和AD4Primer四种随机简并引物，代表一次PCR扩增的平行四组，三次PCR扩增时，使用的随机简并引物必须是同一种引物。3）第一次PCR反应。①配制反应体系，具体如表2.1。表2.1第一次PCR反应体系。Table2.1Thecompositionof1stPCR.试剂使用量TaKaRaLATaq（5U/μL）0.5μL10×LAPCRBufferⅡ（Mg2+plus）5μLdNTPMixture（2.5mMeach）8μLADPrimer（100pmol/μL）1μLSP1Primer（10pmol/μL）1μLTemplate（病毒cDNA）1μLddH2O33.5μL②第一次PCR反应条件94℃1min；98℃1min；（94℃30sec，65℃1min，72℃2min）5个循环；94℃30sec，25℃1min，72℃2min；（94℃30sec，65℃1min，72℃2min；94℃30sec，65℃1min，72℃2min；94℃30sec，44℃1min，72℃2min）15个循环；72℃10min；4℃保存。4）第二次PCR反应。37 ①配制第二次PCR反应体系，具体如表2.2。表2.2第二次PCR反应体系。Table2.2ThecompositionofsecondPCR.试剂使用量TaKaRaLATaq（5U/μL）0.5μL10×LAPCRBufferⅡ（Mg2+plus）5μLdNTPMixture（2.5mMeach）8μLADPrimer（100pmol/μL）1μLSP1Primer（10pmol/μL）1μL第一次PCR反应产物1μLddH2O33.5μL②第二次PCR反应条件94℃3min；（94℃30sec，65℃1min，72℃2min；94℃30sec，65℃1min，72℃2min；94℃30sec，44℃1min，72℃2min）15个循环；72℃10min；4℃保存。5）第三次PCR反应。①配制第三次PCR反应体系，具体如表2.3。38 表2.3第三次PCR反应体系。Table2.3ThecompositionofthirdPCR.试剂使用量TaKaRaLATaq（5U/μL）0.5μL10×LAPCRBufferⅡ（Mg2+plus）5μLdNTPMixture（2.5mMeach）8μLADPrimer（100pmol/μL）1μLSP1Primer（10pmol/μL）1μL第二次PCR反应产物1μLddH2O33.5μL②第三次PCR反应条件94℃3min；（94℃30sec，65℃1min，72℃2min；94℃30sec，65℃1min，72℃2min；94℃30sec，44℃1min，72℃2min）15个循环；72℃10min；4℃保存。6）加入10μL的6×loadingbuffer于上述三次PCR产物，混合，使用1%琼脂糖凝胶电泳，130V条件下进行25min。之后使用凝胶成像系统观察。鉴定结果符合预期的样品，对清晰的电泳条带切胶回收，并使用ND-1000型核酸蛋白检测仪测定回收DNA的质量，送去测序公司测序鉴定。2.2.4.3末端扩增基因末端扩增通常采用的是cDNA末端扩增法（rapidamplificationofcDNAends，RACE），是一种从RNA到DNA并和PCR有效结合，依据靠近末端已知基因序列来扩增末端未知序列的方法。有3’末端扩增即3’RACE和5’末端扩增即5’RACE两种，本研究主要采用了试剂盒的方法，对应的试剂盒分别是3’-Full39 RACECoreSetVer.2.0和5’-FullRACEKit。本研究中的冠状病毒基因组序列是末端扩增的方法扩增。2.2.4.4载体连接、转化及克隆培养病毒基因扩增后，有时会出现测不全、测序出现发卡结构或无法测序等情况，甚至使用末端扩增试剂盒为了方便测序，常需要将扩增产物连接到载体，克隆培养后再进行测序。使用高保真酶扩增的产物，先平末端才能连接到T载体上。具体方法如下：1）对扩增的片段，使用1%琼脂糖凝胶电泳，对明亮的电泳条带切胶。2）使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒对胶回收，并使用核酸蛋白检测仪测量回收DNA的质量。3）在pMD18T载体1μL（50ng，0.03pmol）以及插入DNA的摩尔数比一般为0.1pmol～0.3pmol下，使用公式：插入DNA的使用量（μL）=nmol数×660×InsertDNA的bp数/InsertDNA的质量浓度，算出插入DNA分子使用量。4）在0.2mlPCR管中，配制载体反应体系，见表2.4。表2.4pMD18T载体反应体系。Table2.4ThecompositionofpMD18-TVector.试剂使用量pMD18-T载体1μL插入DNAXμLSolutionⅠ5μLddH2O补加至10μL5）16℃条件下反应过夜。6）从-80℃冰箱中，取出DH5α感受态细胞放置于冰中，直至融化。7）取5μL的载体反应连接液和50μL的DH5α感受态细胞于1.5mL离心管中混合，并放置于冰中冰浴30min。40 8）将离心管放置于42℃恒温60~90sec，然后立即冰浴5min。9）向离心管中加入900μL不含抗生素的LB培养液，混匀。在37℃和转速为150r/min条件下，振荡培养45min。10）将离心管内液体混匀，吸取200μL液体涂抹在含有100ug/mL氨苄抗生素的LB固体琼脂培养基上，37℃条件下培养10~12h。11）待LB固体琼脂培养基上长出单个白色菌落后，用无菌镊子夹取10μl的无菌吸头挑取单个菌落于含有100ug/ml氨苄抗生素的LB液体培养基中进行培养，37℃条件下培养8~10h。12）使用pMD18-T载体测序引物对培养的菌液进行PCR扩增检测。反应体系如表2.5。表2.5检测插入DNA的PCR反应体系。Table2.5ThecompositionofPCRamplificationtodetecttheinsertDNA.试剂使用量2×TaqPCRMasterMix12.5μLM13F(-47)（10pmol/μL）1μLRV-M（10pmol/μL）1μL菌液1μLddH2O9.5μL13）对经过鉴定连接片段大小与连接在提前电泳鉴定条带一致的菌液，使用质粒提取试剂盒提取质粒。14）使用核酸蛋白检测仪对提取的质粒进行测定质量，并送去测序公司测序鉴定。41 2.2.5病毒分离将含有布尼亚病毒、冠状病毒和副粘病毒的蝙蝠样品，从-80℃冰箱中取出放置于冰上。在生物安全柜内，用无菌剪刀剪去火柴头大小的蝙蝠组织样品于玻璃研磨器内，加入预冷的无血清的DMEM培养液进行研磨，再使用离心机在4℃条件下10,000×g离心10min，取上清。依次使用0.45μM和0.22μM的针头滤器过滤，保留含病毒粒子的过滤液。待BHK-21细胞、Vero细胞、Vero-E6细胞和Marc145细胞生长至75%~85%的细胞孔做标记，弃去细胞孔里的培养液，用预热至37℃的无血清DMEM培养液清洗3遍。加入含病毒粒子的过滤液于细胞孔内，六孔板没空需要加入300μL，十二孔板需要加入200μL过滤液接毒。将细胞板放置于含5%CO2的细胞培养箱37℃下孵育1~2h，期间每0.5h轻轻晃动细胞板一次。孵育结束后，弃去细胞孔内接毒液，使用无血清DMEM培养液清洗一遍，六孔板加入2.5mL的无血清DMEM培养液，十二孔板需要加入1.5mL的无血清DMEM培养液，放置于5%CO2的细胞培养箱37℃条件下进行培养，每12h观察一下，看看细胞状态如何以及是否有细胞病变。培养72h后，将细胞板移至-40℃冰箱中，反复冻融3次，使用离心机10,000×g离心10min，收集细胞上清，然后再继续进行接毒，直至细胞产生病变或者接毒至第5代。每代细胞接毒液均留有备份，取备份接毒液，参见1.2.4.3蝙蝠病毒核酸提取及反转录提取核酸，再使用布尼亚病毒、冠状病毒和副粘病毒的特异性检测引物检测。2.3结果2.3.1蝙蝠圆环病毒鉴定结果对黑龙江省两株蝙蝠圆环病毒进行全基因组学分析，哈尔滨市阿城区的BtCV-AC株蝙蝠圆环病毒获得了2117nt基因组序列，大庆市萨尔图区的BtCV-DQ株圆环病毒获得了2113nt基因组序列，比Ge等[91]从云南检测到的蝙蝠圆环病毒短60nt，比其他蝙蝠圆环病毒长。与BtCV-AC株蝙蝠圆环病毒相比，BtCV-DQ株圆环病毒在984位置缺失一个G碱基，在1149至1151位置缺失三个T碱基。在基因组结构方面，同其他圆环病毒一样，均为圆环状结构；通过NCBI在线版的ORFFinder查找，也预测出BtCV-AC株和BtCV-DQ株圆环病毒均具有Rep蛋白和Cap蛋白两种蛋白。使用绘图软件绘制BtCV-AC株和BtCV-DQ株圆环病毒结构示意图，见图2.2。圆环病毒基因组还存在2个与病毒复制和增殖相关的基因区，其中就是在复制原点处，通常存在由11个碱基对形成的回文序列组成，其中就包括保守的9核甘酸基序区域（conservednonanucleotidemotif），而本研究检测到的两株蝙蝠圆环病毒同样也存在这种，它们的9核甘酸基序区域序列均为TAGTATTAC，位置在2101nt至20nt和2105nt至20nt之间[15]，见图2.3。另外，本研究还首次发现圆环病毒存在poly（T）结构，BtCV-AC株圆42 环病毒的poly（T）结构在序列的位置是1127nt至1151nt，长25nt，结构序列为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT；BtCV-DQ株圆环病毒的poly（T）结构在序列的位置是1126nt至1147nt，长22nt，结构序列为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，具体位置如图2.2。图2.2黑龙江省两株蝙蝠圆环毒基因结构图。Figure2.2GenomeschematicsoftwobatcircovirusesinHeilongjiangProvince.43 图2.3黑龙江省两株蝙蝠圆环病毒基因组的茎环结构。Figure2.3Structureofthestem-loopoftwobatcircovirusesinHeilongjiangProvince..对黑龙江省两株蝙蝠圆环病毒进行同源性分析，在全基因组同源性分析中，BtCV-AC株和BtCV-DQ株圆环病毒间的同源性为97.4%，它们均与JZ98/2014株犬圆环病毒和VS7100003株狐狸圆环病毒[21]有最高同源性，分别44 为55.0%和54.5%；同蝙蝠圆环病毒比，均与缅甸国马铁菊头蝠的蝙蝠圆环病毒XOR7株[12]核苷酸序列同源性最高，分别为45.2%和44.5%；与其他蝙蝠圆环病毒的同源性分别在30.9~43.1%和31.3~42.0%；与圆环病毒属（Circovirus）已确定种的圆环病毒同源性分别在38.3~45.8%和38.1~45.4%；这两株蝙蝠圆环病毒与我国流行的猪圆环病毒同源性在44.2~45.1%，见表2.6。Rep的核苷酸序列同源性方面，BtCV-AC株和BtCV-DQ株这两株圆环病毒间的同源性为98.2%，它们均与VS7100003株狐狸圆环病毒有最高同源性，分别为65.1%和67.1%；同蝙蝠圆环病毒相比，均与缅甸国马铁菊头蝠XOR株蝙蝠圆环病毒[12]的核苷酸序列存在最高同源性，分别为58.6%和59.3%；与其他蝙蝠圆环病毒的同源性分别在43.6~58.3%和41.9~57.5%；与圆环病毒属（Circovirus）已确定种的圆环病毒同源性分别在50.1~59.3%和52.1~59.1%；这两株蝙蝠圆环病毒与我国流行的猪圆环病毒同源性在58.3~59.8%，见表2.6。Rep的氨基酸序列同源性方面，BtCV-AC株和BtCV-DQ株这两株圆环病毒间的同源性为99.3%，它们均与VS7100003株狐狸圆环病毒有最高同源性，分别为67.5%和67.6%；同蝙蝠圆环病毒相比，均与缅甸国马铁菊头蝠XOR株蝙蝠圆环病毒的氨基酸序列存在最高同源性，分别为56.7%和57.8%；与其他蝙蝠圆环病毒的同源性分别在35.6~55.1%和35.0~54.6%；与圆环病毒属（Circovirus）已确定种的圆环病毒同源性分别在50.1~58.3%和49.9~58.1%；与我国流行的猪圆环病毒同源性在57.8~58.3%，见表2.6。Cap的核苷酸序列同源性方面，BtCV-AC株和BtCV-DQ株这两株圆环病毒间的同源性为96.8%，它们与JZ98/2014株犬圆环病毒和VS7100003株狐狸圆环病毒有最高同源性，分别为47.9%和46.9%；同蝙蝠圆环病毒相比，均与缅甸国马铁菊头蝠XOR株蝙蝠圆环病毒的核苷酸序列存在最高同源性，分别为58.6%和59.3%；与其他蝙蝠圆环病毒的同源性分别在36.1~44.1%和36.7~43.5%；与圆环病毒属（Circovirus）已确定种的圆环病毒同源性分别在33.2~46.1%和34.0~45.6%；与我国流行的猪圆环病毒同源性在43.7~45.0%，见表2.6。Cap的氨基酸序列同源性方面，BtCV-AC株和BtCV-DQ株这两株圆环病毒间的同源性为98.2%，它们均与JZ98/2014株犬圆环病毒有最高同源性，分别为42.3%和42.0%；同蝙蝠圆环病毒相比，均与缅甸国马铁菊头蝠XOR株蝙蝠圆环病毒的氨基酸序列存在最高同源性，分别为35.0%和34.7%；与其他蝙蝠圆环病毒的同源性分别在28.5~33.3%和28.7~33.1%；与圆环病毒属（Circovirus）已确定种的圆环病毒同源性均在24.4~37.1%；与我国流行的猪圆环病毒同源性在36.9~38.2%，见表2.6。另外，使用Cap氨基酸序列，用MEGA6.06软件及邻间法构建系统进化分析，如图2.4。黑龙江省东方45 蝙蝠这两株圆环病毒均处于圆环病毒属进化分支内，与VS7100003株狐狸圆环病毒和JZ98/2014株犬圆环病毒近缘。图2.4使用242aa的CP氨基酸序列和邻间法构建系统进化分析。本研究的序列标记为黑四边形，其他蝙蝠布尼亚病毒标记为白四边形。Figure2.4FamilyCircoviridae:neighbour-joiningphylogenetictreebuiltwiththelengthof242aaofCPaminoacidsequences.Sequencesfromourstudyareidentifiedbyfilledquadrangle,withotherbatcircovirusesasopenquadrangle.46 表2.6BtCV-AC株病毒基因同源性分析。Table2.6PercentidentityofBtCV-AC.BtCV-AC株圆环病毒同源性分析（%）BtCV-DQ30株同源性分析（%）病毒种基因登陆号病毒名CompleteRepCapCompleteRepCapntntaantaantntaantaaBeakandfeatherAF080560BFDV40.453.852.046.135.840.556.552.345.635.5diseasevirusCanarycircovirusAJ301633CaCV40.250.150.742.532.040.054.750.941.731.7DuckcircovirusAY228555DuCV39.555.453.837.627.438.557.654.436.927.4FinchcircovirusDQ845075FiCV41.055.956.542.433.641.159.056.542.433.3GoosecircovirusAJ304456GoCV39.754.653.341.733.138.856.953.641.433.3GullcircovirusDQ845074GuCV38.354.050.134.527.438.154.749.934.027.4PigeoncircovirusAF252610PiCV38.351.652.033.224.438.152.152.034.324.4Porcinecircovirus-2AF027217PCV-2-pws44.659.358.344.037.144.058.458.144.037.1Porcinecircovirus-1Y09921PCV145.858.957.344.136.345.457.657.343.736.3StarlingcircovirusDQ172906StCV40.355.556.234.025.540.359.156.234.025.2SwancircovirusEU056309SwCV39.954.852.542.630.939.156.652.842.031.2Porcinecircovirus-2AY686764PCV2-ZJ45.059.558.344.537.744.458.458.144.937.9HM038027PCV2-SH44.959.358.044.537.444.358.357.844.737.7HM038034PCV2-LG45.159.858.343.936.944.459.058.143.736.9HM641752PCV2-DBN-SX07245.059.358.344.737.744.458.358.144.937.9FJ598044PCV2-WH44.859.458.344.837.944.258.558.145.038.247 UnclassifiedcircovirusDQ146997RaCV-4113140.352.955.143.933.940.057.855.244.433.9KP260926FoCV-VS710000355.065.167.547.541.754.567.167.646.941.5KT946839CaCV-JZ98201455.064.367.347.942.354.566.666.846.942.0JF938078BtCV-YN-130.944.739.138.428.531.945.438.538.828.7JF938079BtCV-YN-234.048.645.937.030.933.950.045.937.530.9JF938080BtCV-YN-333.948.744.136.129.835.750.844.336.929.5JF938081BtCV-YN-433.847.743.836.229.333.849.043.836.829.3JF938082BtCV-YN-532.346.144.936.532.232.448.645.438.332.2JX863737BtCVXOR43.158.656.739.130.942.059.357.839.130.9KC339249BtCV-XOR745.258.355.144.435.044.557.554.644.034.7KJ641718BtMf-CV-1/GD201231.443.643.337.330.932.448.043.537.730.9KM382269BtCV/POA-2012-II33.048.345.438.429.834.850.545.438.329.8KM382270BtCV/POA-2012-VI32.244.635.636.629.331.341.935.036.729.3KT783484BtCV/TBCV137.255.351.244.133.339.557.952.343.533.1BtCV-AC97.498.299.396.898.2注：表中PCV2-ZJ、SH、LG、DBN-SX072和WH五株猪圆环病毒2型均为我国流行疫苗株。48 2.3.2蝙蝠布尼亚病毒鉴定结果BtBunV-JTM株布尼亚病毒序列注释到了布尼亚病毒科（Bunyaviridae）白蛉热病毒属（Phlebovirus）。使用特异性检测引物，从吉林通化市马铁菊头蝠中检测出了8只蝙蝠携带布尼亚病毒，使用了易感细胞如Vero细胞、Vero-E6细胞和BHK-21细胞进行病毒分离，没有产生细胞病变，并且通过特异性PCR检测，也没有从细胞接毒液中检测到布尼亚病毒基因存在。白蛉热病毒属是分节段病毒，有S片段、M片段和L片段三个片段，其中S片段长为1.6~1.8kb左右，M片段为3~4.5kb左右，L片段常为6.4kb左右[13,14]，如图2.5（A）。通过全基因组学分析，共获得了1476nt长序列，主要集中在L片段，如图2.5（B）。系统进化分析，发现与从我国陕西皮氏菊头蝠中检测到Rp-BunyaV/Shaanxi2011株蝙蝠布尼亚病毒[10]的同源性最高，能达到60.9%；与印度棕果蝠中检测到的两株蝙蝠布尼亚病毒MalsoorvirusstrainNIV1050639株和NIV1050650株同源性达到42.7%；与几内亚的南非蹄蝠检测到裂谷热病毒RVFVstrainANK-3837和非洲小狐蝠检测到的裂谷热病毒RVFVstrainANK-6087同源性达到41.8%；与白蛉热病毒属（Phlebovirus）已确定种的病毒株同源性在35.0%~44.5%，见图2.5（C）和表2.7。BtBunV-JTM株的L片段的氨基酸序列同样也与从我国陕西皮氏菊头蝠中检测到的蝙蝠布尼亚病毒Rp-BunyaV/Shaanxi2011同源性最高，能达到52.5%；与印度棕果蝠中检测到的两株蝙蝠布尼亚病毒，同源性达到28.8%，与几内亚南非蹄蝠和非洲小狐蝠的裂谷热病毒同源性也达到28.4%；与白蛉热病毒属（Phlebovirus）已确定种的病毒株同源性在27.0%~31.8%，见图2.5（C）和表2.7。在系统发生树中，BtBunV-JTM株布尼亚病毒与Rp-BunyaV/Shaanxi2011株蝙蝠布尼亚病毒处于同一进化分支，但是和已确定为白蛉热病毒属（Phlebovirus）病毒种的亲缘性有点较远。49 图2.5BtBunV-JTM株病毒L蛋白的氨基酸序列系统进化分析。本研究的序列标记为黑四边形，其他蝙蝠布尼亚病毒标记为白四边形。Figure2.5PhylogeneticanalysisofBtBunV-JTMwithotherbatbunyavirusandmembersinthegenusofPhlebovirus.Sequencesfromourstudyareidentifiedbyfilledquadrangle,withotherbatbunyavirusesasopenquadrangle.50 表2.7BtBunV-JTM株病毒基因同源性分析。Table2.7PercentidentityofBtBunV-JTM.采样同源性（%）病毒种病毒名GeneBank宿主国家时间ntaaSalehabadvirusAdanavirusKJ939330白蛉土耳其201242.427.0SandflyfeverNaplesvirusKarimabadvirusisolateI-58KF297912白蛉伊朗195942.027.6SandflyfeverNaplesvirusToscanavirus-ISS.Phl.3X68414白蛉美国198142.527.8UukuniemivirusUukuniemivirus-S23D10759蜱芬兰198744.231.0UukuniemivirusEgAN1825-61virusHM566159欧柳莺埃及201044.531.8RiftValleyfevervirusRVFV-derivativeM12X56464人埃及197742.227.6PuntaTorovirusBuenaventuravirusstrainCoAr3319KP272001新西兰沙蝇哥伦比亚196442.827.4CandiruvirusMaldonadovirusstrainFMD0077HM119413智人秘鲁200442.027.4CandiruvirusAlenquervirusHM119401智人巴西197642.729.2BujaruvirusMungubavirusHM566164NANA201035.030.4RiftValleyfevervirusRVFVstrainANK-3837DQ375420南非蹄蝠几内亚198141.828.4RiftValleyfevervirusRVFVstrainANK-6087DQ375421非洲小狐蝠几内亚198441.828.4UnclassifiedBunyaviridaeBatRp-BunyaV/Shaanxi2011KC154063皮氏菊头蝠中国陕西201160.952.5UnclassifiedPhlebovirusMalsoorvirusstrainNIV1050639KF186494棕果蝠印度201042.728.8UnclassifiedPhlebovirusMalsoorvirusstrainNIV1050650KF186497棕果蝠印度201042.728.8NA：表示没有对应的数据。51 2.3.3蝙蝠副粘病毒鉴定结果病毒宏基因组学结果中3条病毒序列注释到副粘病毒科（Paramyxoviridae）腮腺炎病毒属（Rubulavirus）。在第一章中，使用特异性PCR检测引物，检测出了2只蝙蝠携带副粘病毒，取这两只蝙蝠组织用于细胞接毒。使用Vero细胞、Vero-E6细胞、BHK-21细胞和Mar145细胞四种细胞，没有产生细胞病变，并且细胞接毒也提取的RNA且通过特异性PCR检测，也没有检测到副粘病毒基因存在，均未分离成功。腮腺炎病毒属（Rubulavirus）病毒基因组是不分节段病毒，其全基因组为15kb左右，能够编码7个蛋白[23,24]，如图2.6（A）。经过全基因组扩增，共获得了5318nt长基因序列，其中包括N蛋白基因长1681nt、V/P蛋白基因长1170nt以及L蛋白基因长2061nt，如图2.6（B）。依据BtPV-JTA株已扩增的病毒基因，进行了同源性分析。BtPV-JTA株的L基因是整个基因组中最大的一个基因，同时L蛋白基因也是最常用作系统进化分析[24,92]。它与与日本人副流感病毒4a型M-25株病毒[30]同源性最高，达到71.8%；与其他已确定种的病毒基因序列的同源性在60.6%~62.3%之间；与中国棕果蝠源副粘病毒Tuhokovirus2ThkPV-2株和巴西黄肩蝠源副粘病毒MapueravirusisolateBeAnn370284株均出现了较高的同源性，达到了60.2%，与其他蝙蝠副粘病毒同源性却在58.1%~59.7%，见图2.7和表2.8。BtPV-JTA株的N基因，同样与日本人副流感病毒4a型的M-25株病毒同源性最高，达到69.7%；与其他已确定种的蝙蝠副粘病毒的同源性在46.8%~49.5%；与蝙蝠副粘病毒相比，和加纳的稻草色食果蝙蝠源的蝙蝠副粘病毒Achimotavirus1AchPV1同源性最高，达到52.7%，而其他蝙蝠副粘病毒的同源性却在49.7%~5.3%，见图2.7和表2.8。另外，BtPV-JTA株病毒中N基因与L基因均与人副流感病毒具有最高同源性且在系统进化树中与人副流感病毒处在同一分支，又是同一蝙蝠样品中扩增出的基因，因此N基因和L基因应为同一病毒的基因且处在不同位置，基因结构图见图2.6。图2.6BtPV-JTA株副粘病毒基因结构图。获得的基因序列为B图实线部分。Figure2.6GenomeschematicsofBtPV-JTA.Sequencesweacquiredisfilledwithfullline.52 图2.7A图、B图分别为使用1260nt长度的N基因和2061nt长度的L基因对BtPV-JTA株病毒进行系统进化分析。本研究的序列标记为黑四边形，其他蝙蝠副粘病毒标记为白四边形。Figure2.7Thelengthof1206ntofNgene(A)andthelengthof2061ntofLgene(B)fragmentbasedphylogeneticanalysisofbatparamyxovirusandmembersinthegenusofRubulavirusandothergenus.Sequencesfromourstudyareidentifiedbyfilledquadrangle,withotherbatrubulavirusesasopenquadrangle.53 表2.8BtPV-JTA株病毒核苷酸同源性分析。Table2.8PercentidentityofthenucleotidesequencesofBtPV-JTA.采集同源性分析（%）病毒种基因型基因登录号国家宿主日期N蛋白L蛋白Humanparainfluenzavirus2Humanparainfluenzavirus2strainV94AF5330101994美国人46.860.6Humanparainfluenzavirus4Humanparainfluenzavirus4astrain：M-25AB5433361966日本人69.771.6Humanparainfluenzavirus4bstrain：68-333AB5433371968日本人69.571.8MapueravirusMapueravirusisolateBeAnn370284EF0954901979巴西黄肩蝠50.160.2MumpsvirusMumpsvirusMiyaharaAB0408741984日本鼠48.762.3Parainfluenzavirus5Simianparainfluenzavirus5AF0527551964英国猴48.460.7PorcinerubulavirusPorcinerubulavirusLPMVBK0059181980墨西哥猪49.560.7Simianvirus41Simianvirus41Toshiba/ChanockX64275NANANA47.360.6UnclassifiedRubulavirusTiomanvirusAF2988951999马来西亚小狐蝠50.858.1MenanglevirusAF3261141997澳大利亚猪51.258.5Achimotavirus1AchPV1JX0513192010加纳稻草色果蝠52.759.1Achimotavirus2AchPV2JX0513202010加纳稻草色果蝠51.359.7MenanglevirusAustralia/bat/2009JX1127112009澳大利亚大蝙蝠狐蝠51.158.7Tuhokovirus1ThkPV-1GU1280802006中国棕果蝠50.359.1Tuhokovirus2ThkPV-2GU1280812006中国棕果蝠50.160.2Tuhokovirus3ThkPV-3GU1280822006中国棕果蝠49.758.554 2.3.4蝙蝠冠状病毒鉴定结果冠状病毒是单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒亚科（Coronavirinae）。通过特异性PCR检测到两株冠状病毒，分别是α冠状病毒属（Alphacoronavirus）的BtCoV-JTAC2株病毒和β冠状病毒属（Betacoronavirus）的BtCoV-JTMC15株病毒。对于这两株冠状病毒病毒分离中，使用敏感细胞接毒，没有产生细胞病变，并且冠状病毒细胞接毒提取RNA并通过特异性PCR检测，也没有检测到冠状病毒基因存在，没有成功分离病毒。通过全基因组扩增，JTAC2株冠状病毒获得了25719nt长的冠状病毒基因序列，JTMC15株冠状病毒获得了28761nt长的基因序列。经过序列比对分析，JTAC2株冠状病毒基因组除了两端序列不完整外，其他部分基因均完整，全基因组序列与我国河南检测到的冠状病毒具有较高的同源性，能达到81.5%。而JTMC15株冠状病毒与我国吉林省马铁菊头蝠检测到的SARS样冠状病毒JL2012株[10]出现了高度同源性，去除两株病毒基因组不完整部分，同源性能达到99.7%。由于JL2012株中间部分没有出现基因缺失前后两端没有获得完整序列，没有做后续分析，而本研究JTMC15株却在序列中间出现了基因缺失现象，出现了ORF1a和N两处基因缺失，在ORF1a处缺失的现象与SARS-CoVShanghaiQXC2和SARSr-BatCoVRs672[93]两株冠状病毒相似，存在579nt的缺失，而在基因组中存在整个基因8的缺失，现如今还没有冠状病毒存在这种现象。使用JTMC15的全基因组序列与其他SARS和SARSr-CoV病毒进行同源性分析与比较，也验证了这种现象，见图2.8和表2.9。使用MEGA6.06软件的最大似然法（Maximun-Likelihood）及Bootstrap值为1000对JTAC2和JTMC15两株病毒的RdRP蛋白基因系统进化分析，发现吉林新型α毒株JTAC2与其他蝙蝠毒株同源性相近，尤其是从我国河南省检测到的这两株蝙蝠冠状病毒处在同一进化分支，见图2.9。新型β毒株JTMC15处于β2冠状病毒群，为SARS样冠状病毒，见图2.9。55 图2.8JTAC2、JTMC15和JPDB144（另外一株蝙蝠冠状病毒）三种病毒基因预测图。A图中结构蛋白为灰色框，非结构蛋白为空白框。B图中Hu为人SARS冠状病毒；Ci为果子狸SARS冠状病毒；Bt为蝙蝠SARS冠状病毒。Figure2.8ThepredictedgenesofJTAC2,JTMC15andJPDB144.(A)Structuralproteinsbyfilledboxes,nonstructuralproteinsarerepresentedbyopenboxes.56 图2.9JTA2株和JTMC15株冠状病毒RdRP基因系统进化分析。本研究涉及到的病毒序列用黑色四边形标出。57 Figure2.9PhylogeneticanalysisofRdRPgeneofJTMC15andJTAC2.Sequencesfromourstudyareidentifiedbyfilledquadrangle.表2.9JTMC15株病毒与其他SARS冠状病毒、SARS样冠状病毒氨基酸同源性比较。Table2.9PercentidentityofaminoacidsequencesofJTMC15andotherSARS-CoVandSARSr-CoVs.JTMC15Rf1Rs672BJ01ORFLengthLength%Length%Length%1a4185437898419093.8438393.51b2704270498.1270498.1270498S1236124186.1125581.9124176.73a27427498.22749227486.23b11411497.411491.311490.4E767694.87696.17696.1M22122199.122198.222197.76636396.96392.26389.17a12212298.412293.512291.97b5244834484.94479.28(8a)£-122-121-39--(8b)-----84-N42042198.142296.742296.29a979794.99879.69879.69b707094.47083.17084.5注：上表中简写序列名和序列登录号：Rf1为DQ412042；Rs672为FJ588686；BJ01为AY278488。£表中基因8是SARS-CoVs的基因8a和8b。2.4讨论蝙蝠源圆环病毒的检测历史很短，2010年Li等首次在北美地区检测到蝙蝠圆环病毒，而Ge等在2011年从我国检测到蝙蝠圆环病毒的存在，随后在2012年Wu等对我国北京、云南和贵州等六个地方进行了筛查，在北京市蝙蝠样品中检测到了一株蝙蝠圆环病毒[10,73,74]。本实验室对蝙蝠圆环病毒的工作始于2011年，并在缅甸国的蝙蝠样品检测出两株蝙蝠圆环病毒[12]。本研究是首次从在黑龙江省蝙蝠体内检测到两株圆环病毒，并获得了蝙蝠圆环病毒的全基因组序列。通过对基因进行分析，本研究检测到的两株蝙蝠圆环病毒均存在poly（T）结构，58 这是首次在圆环病毒中发现这种结构。另外，通过分析发现，这两株蝙蝠圆环病毒的全基因组间同源性为97.4%，Cap核苷酸同源性为96.8%，Cap氨基酸同源性为98.2%；这两株蝙蝠圆环病毒与其他圆环病毒相比，全基因组核苷酸序列均与JZ982014株犬圆环病毒和VS7100003株狐狸圆环病毒存在最高同源性，分别为55.0%和54.5%；BtCV-AC株和BtCV-DQ株这两株圆环病毒的Cap核苷酸序列同源性与JZ98/2014株犬圆环病毒和VS7100003株狐狸圆环病毒有最高同源性，分别为47.9%和46.9%；同时这两株蝙蝠圆环病毒的Cap氨基酸序列同源性均与JZ98/2014株犬圆环病毒有最高同源性，分别为42.3%和42.0%。依据ICTV分类报告关于对圆环病毒属种的划分标准，从黑龙江省检测到的这两株蝙蝠圆环病毒同为圆环病毒属的一个新种[16]。另外，本次从黑龙江省东方蝙蝠检测到的这株圆环病毒，与我国流行的猪圆环病毒2型均存在较低的同源性，在一定程度上排除了蝙蝠携带这株圆环病毒与国内家猪圆环病毒的关系。同时也值得注意的是，辽宁省和吉林省这三种蝙蝠均没有检测到蝙蝠圆环病毒的存在，只有黑龙江省的东方蝙蝠检测出了蝙蝠圆环病毒，所以东方蝙蝠在我国东北地区可能就是蝙蝠圆环病毒的自然宿主。另外，本研究在黑龙江省哈尔滨市阿城区蝙蝠身上的蝙蝠虫（Batbugs）也检测到了圆环病毒，并获得了全基因组序列，基因组的全长与阿城区的这株蝙蝠圆环病毒一致，并且开放阅读框的位置都是一致的，但两条病毒基因组序列并不是完全一致，同源性有98.1%，按照ICTV的分类标准，这两株蝙蝠圆环病毒为同一个圆环病毒种[16]。也间接验证了东北地区圆环病毒与我国及周边地区检测到的圆环病毒存在地域差异。白蛉热病毒属囊括了多种烈性传染病，比如西西里白蛉热病毒、乌库尼米病毒、裂谷热病毒等，主要通过白蛉进行传播，也可以通过蚊子、蜱虫甚至是蝙蝠传播[13,94]，后者的数量比较少，现仅有8种蝙蝠源白蛉热病毒。在这8种蝙蝠白蛉热病毒中，蝙蝠源裂谷热病毒AnK6087株是首次从几内亚的南非蹄蝠中被检测到的一种蝙蝠白蛉热病毒[95]。而我国，目前还没有在蝙蝠体内检测到白蛉热病毒属的病毒，Rp-BunyaV/Shaanxi2011株也仅是与白蛉热属病毒同源性较高。在本研究中，通过病毒宏基因组学技术筛查，在吉林省通化市马铁菊头蝠内的病毒基因注释到白蛉热病毒属，但经过特异性检测、扩增及分析，结果显示与我国陕西皮氏菊头蝠携带的布尼亚病毒Rp-BunyaV/Shaanxi2011株病毒[10]具有60.9%的同源性，并且也与这株布尼亚病毒处在同一进化分支；与其他白蛉热病毒属的病毒同源性均较低，与埃及欧洲莺检测到的白蛉热病毒属乌库尼米病毒EgAN1825-61virus株病毒[96]有44.5%的同源性。同时，蝙蝠白蛉热病毒相关数据均比较少，但也能说明蝙蝠也是白蛉热病毒的一个自然宿主，这为蝙蝠白蛉热病毒以后研究提供了病毒组学上的一些基本数据。59 自2001年Chua等首次从马来西亚的小狐蝠中检测到蝙蝠源刁曼病毒(Tiomanvirus)后，就有大量蝙蝠源的腮腺炎病毒属相继被检测到以及Wang等从巴西国的黄肩蝠中检测到蝙蝠源马普埃拉病毒(Mapueravirus)，而在我国Lau等于2010年首次从广东省检测到三株蝙蝠腮腺炎病毒Tuhokovirus[27,97,98]。对于蝙蝠腮腺炎病毒的检测主要是在南方展开，在北方甚至东北地区还没有从蝙蝠体内检测到蝙蝠腮腺炎病毒。本研究通过病毒宏基因组学技术，却在吉林通化市的白腹管鼻蝠中检测到一株蝙蝠腮腺炎病毒，本研究记作蝙蝠副粘病毒。与已知的蝙腮腺炎病毒属的病毒以及该属蝙蝠源病毒相比，与日本检测到的人副流感病毒4型[30]具有较高的亲缘关系，N基因的同源性69.7%，L基因为71.6%。与我国已检测到的蝙蝠副粘病毒均没有较高的同源性，与从加纳国稻草色食果蝙蝠检测到的Achimotavirus[99]具有52.7%的同源性，与从我国广东检测到的蝙蝠源腮腺炎病毒Tuhokovirus具有50.3%的同源性。另外，在我国云南地区也检测到一株蝙蝠腮腺炎病毒RubulavirusYN12137/CHN/2012株病毒[8]，病毒序列较短，缺乏可分析的基因序列长度，利用可比对上的L片段进行分析，发现同源性为61.3%，我国其他地方暂时没有检测到蝙蝠携带腮腺炎病毒基因数据。从吉林省检测到的蝙蝠副粘病毒由于与现有的蝙蝠腮腺炎病毒存在较低的同源性，可能也与未来从我国其他地方检测到的蝙蝠腮腺炎病毒存在地域差异，同样也为以后对蝙蝠腮腺炎病毒的研究提供了基因组学上的数据。冠状病毒是一种具有囊膜的单股正链且最大的RNA病毒[31,100]。自2002年冬到2003年5月，全球爆发了严重的急性呼吸道综合症（SARS）疾病，造成了8098人感染和至少776人死亡[101,102]，引发了重大的公共卫生学风险。因此，作为SARS的病因就是冠状病毒[101,103,104]，也备受关注。2012年又爆发了中东呼吸综合征（MiddleEastrespiratorysyndrome），引起了104感染，49人死亡[105]，这也使得越来越多的人对冠状病毒进行研究。冠状病毒的研究始于1947，首先从鸡身上检测到，在20世纪60年代从人体内检测到第一株人源冠状病毒，之后关于冠状病毒的研究就不断增加，尤其是在SARS爆发后，多宿主多种新型冠状病毒不断被报道，尤其是人体内发现已有6种冠状病毒可以感染人，分别是OC43株人冠状病毒、229E株冠状病毒、SARS冠状病毒、NL63株人冠状病毒、HKU1株人冠状病毒和MERS冠状病毒[31,100,106-112]。而蝙蝠冠状病毒，则是Tang等首次在2005年在我国多种蝙蝠体内检测到蝙蝠冠状病毒存在，到目前为止我国至少在个省内检测到二十多种蝙蝠冠状病毒，同时也说明了菊头蝠科和蝙蝠科两个科是我国蝙蝠冠状病毒的主要自然宿主[1,32,33,113,114]。我国蝙蝠冠状病毒分布图，见图2.10。60 图2.10我国蝙蝠携带蝙蝠冠状病毒分布图。Figure2.10Geo-locationofthebatcoronavirusinChina.在本研究中，从吉林省通化市检测到两株蝙蝠冠状病毒，其中有一株蝙蝠冠状病毒是α冠状病毒属（Alphacoronavirus），另外一株是β冠状病毒属（Betacoronavirus）的SARS样冠状病毒。这两株蝙蝠冠状病毒中，其中β冠状病毒属（Betacoronavirus）这株SARS样冠状病毒是在我国东北地区检测到的，与SARSr-Rh-BatCoVRf1和SARS-BtCoV273两株[32,33]蝙蝠源冠状病毒具有较高的同源性，与JL2012株冠状病毒具有非常高的同源性，这两株冠状病毒虽出在同一个地方，但是在基因组结构方面，二者差异却非常大，JL2012株病毒没有序列缺失现象，而本研究检测到的这株冠状病毒出现了ORF1a和N两处基因缺失，在ORF1a处缺失的现象与SARS-CoVShanghaiQXC2和SARSr-BatCoVRs672[93]两株冠状病毒相似，而在基因组N处中存在基因缺失，与Rp/Shaanxi2011株冠状病毒、Rm1株冠状病毒和279/2005株冠状病毒等[32,33,113]三株冠状病毒基因缺失具有相同的现象。另外，JTMC15株冠状病毒存在整个基因8的缺失，这种基因缺失现象一直都存在，如我国南方地区SARS冠状病毒基因存在基因8部分基因缺失，有9nt和82nt等[115,116]不同程度不同位置的缺失。像基因8或其他61 片段的基因突变，一般都是非同义突变位点，并不影响病毒的活性，但像JTMC15株冠状病毒这种整个基因8的缺失，这种现象极为罕见。总之，本研究首次从我国东北三省蝙蝠中检测并鉴定了蝙蝠圆环病毒、蝙蝠副粘病毒、蝙蝠布尼亚病毒以及蝙蝠冠状病毒等新型蝙蝠病毒，并从基因组学角度对这些病毒进行分析，获得病毒组学数据。同时，这些病毒的鉴定也极大地丰富了我国蝙蝠病毒的数据库，同时也为以后科研人员对东北三省蝙蝠病毒的研究提供了基因组学上的基础数据。62 结论一、首次全面描述东北三省蝙蝠携带病毒的本底情况，为了解东北三省蝙蝠病毒分布情况提供了重要的基础数据。二、鉴定并分析博卡病毒、心病毒、环状病毒、水泡性病毒、布尼亚病毒、副粘病毒、圆环病毒、冠状病毒等8个病毒科9个病毒属10种病毒，完成了相关病毒的流行病学调查，其阳性率为2.5%~100%。三、获得了一株博卡病毒、两株圆环病毒、两株冠状病毒的全基因组序列。其中首次从圆环病毒中发现特殊的PolyT结构，而一株冠状病毒在ORF1a和整个ORF8发生缺失。63 64 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74 附录附录1溶液配制一、缓冲液配制1、SM缓冲液配制先配制1MTris–HCl（pH7.5）溶液：①先用天平称量121.1gTris于1L烧杯中；②加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解；③在酸碱测定仪下，加入约70mL的浓盐酸，调节pH至7.5；④使用容量瓶定容至1L后，分装并高压灭菌，室温保存。再配制1×SM缓冲液（不加明胶）：①先称取MgSO4•7H2O试剂2g和NaCl试剂5.8g于1L烧杯中；②加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；③再加入50mL的Tris-Cl(1M,pH7.5)④使用容量瓶定容1L；⑤高压灭菌并在室温保存。2、10×TE缓冲液配制先配制1MTris–HCl（pH8.0）溶液：①先用天平称量121.1gTris于1L烧杯中；②加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解；③在酸碱测定仪下，加入约70ml的浓盐酸，调节pH至8.0；④使用容量瓶定容至1L后，分装并高压灭菌，室温保存。再配制0.5MEDTA（pH8.0）溶液：①先用天平称量186.1g的Na2EDTA·2H2O于1L烧杯中；②加入约800mL的去离子水，充分搅拌；③用NaOH调节pH值至8.0（约20gNaOH方可使EDTA完全溶解）；75 ④加去离子水将溶液定容至1L；⑤高温高压灭菌，并分装室温保存。最后配制10×TE缓冲液：①量取100mL的Tris-Cl(1M,pH8.0)溶液和20ml的0.5MEDTA（pH8.0）溶液于1L烧杯中；②向烧杯中加入约800mL的去离子水，混合均匀；③测量pH值，在7.9~8.0（±0.5）范围内即可，并将溶液定容至1L；④高温高压并分装室温保存。3、TAE电泳缓冲液配制①先用天平称量37.2g的Na2EDTA·2H2O和242g的Tris于1L烧杯中；②加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；③加入57.1mL的醋酸，充分搅拌；④加去离子水定容至1L后，室温保存。二、细菌培养基1、LB液体培养基配制①先用天平称量10g的Tryptone、5g的YeastExtract和10g的NaCl于1L烧杯中；②加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；③加NaOH调节pH至7.0；④加去离子水定容至1L；⑤高温高压灭菌，4℃保存。2、含100μg/ml氨苄西林LB液体培养基配制①先用天平称量10g的Tryptone、5g的YeastExtract和10g的NaCl于1L烧杯中；②加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；76 ③加NaOH调节pH至7.0；④加去离子水定容至1L；⑤高温高压灭菌，待冷却至55~65℃后，加入1mL的Ampicillin（100mg/mL）；⑥4℃保存。3、含100μg/mL氨苄西林LB固体琼脂培养基配制①先用天平称量10g的Tryptone、5g的YeastExtract、10g的NaCl和20g的Agar于1L烧杯中；②加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；③加NaOH调节pH至7.0；④加去离子水定容至1L；⑤高温高压灭菌，待冷却至55~65℃后，加入1mL的Ampicillin（100mg/mL）；⑥4℃保存。77 附录2引物附表1本研究用到的引物。Table1Theprimersusedinthisstudy.TargetPrimernameSequence（5'→3'）BatcytochromeBPrimerSATGACCAACATYCGIAAATCHCAYCCPrimerAGGAGGAAGTGCAGGCRAARAATCGCircovirusCV-FAGCTCATTGCGAGAAGGCTAGCV-01RATCTCAGCAGATCATCAAAGGGCV-02RAATTACCACGGTCTCGTGTCCPhlebovirusBunV01FGGAATGAATCCATTCTTAGCBunV01RGCTGCTCTTATCTTATGTCTGBunV02FGACTATGGTGGAAGAAACTGBunV02RAGCTTGTTCTCTGGATGTGRubulavirusPara01FCTTTCTCAGGTGAGCTTGPara01RTGTGCCTTGATGTTTCATGPara02FTCAGGTGAGCTTGTAAAGCPara02RCTCTACACCATACTGAAAGTAGCoronavirusCoV01FATGGGWTGGGAYTAYCCIAARTGCoV01RTGYTGIGARCAAAAYTCRTGCoV02FGGITGGGAYTAYCCIAARTGYGACoV02RCCRTCATCWGAIARWATCATCAT78 BocavirusBoV-01FCACGCTCATCCTGACTTGGBoV-01RGCACTTGGCCTGCTCTACBoV-02FACGCTCATCCTGACTTGGBoV-02RGAAGCTCTTGTTCTGGTGATTGVesiculovirusVSV01FTATCTCACAATCCAGCAAGACCVSV01RGCACTCAAGTCCTCTAATCAGGVSV02FTCACAATCCAGCAAGACCTATTCVSV02RGGTGCAGATGACCTGATTATCCOrbivirusOrbV01FTGCTTATGGTGACATTAGGAGATGOrbV01RACATCTTTCTAGGGCGTAACTTCOrbV02FGACATTAGGAGATGGACGTATCGOrbV02RTAACTCCTTCGCCTTCTTTCTCCardiovirusCaV01FGACCCTGACTGGCATTGGCaV01RGTGGCAGAACACCCAGAGCaV02FCCTGACTGGCATTGGTCTTACCaV02RACAGAATGAGCAAGGGACATTAG染色体步移引物AD1NTCGASTWTSGWGTTAD2NGTCGASYGANAWGAAAD3WGTGNAGWANCANAGAAD4AGWGNAGWANCAWAGG79 附录3基因登录号附表2本研究中病毒基因序列的基因登录号Table2ThegenebanknumberofthegenomeofbatvirusinthethreenortheasternprovincesofChina.病毒病毒株采样地点蝙蝠种类基因登录号基因区域博卡病毒BtBoV-JL吉林省通化市马铁菊头蝠KX343069全基因组水泡性病毒BtVSV-LN辽宁省本溪市马铁菊头蝠KX343071L蛋白已提交N蛋白心病毒BtPV-TJTB吉林省通化市大足鼠耳蝠已提交Poly蛋白环状病毒BtOrbV-LN1辽宁省本溪市大足鼠耳蝠KX343070VP3蛋白KX161703VP4蛋白布尼亚病毒BtBunV-JTM吉林省通化市马铁菊头蝠KX064237L蛋白副粘病毒BtPV-JTA吉林省通化市白腹管鼻蝠KX064232N-P/V蛋白KX343068L蛋白冠状病毒BtCoV-JTM吉林省通化市马铁菊头蝠KU182964全基因组BtCoV-JTA吉林省通化市白腹管鼻蝠KU182966全基因组80 个人简介基本资料：姓名：李兴宇性别：男出生年月：1989.10民族：汉族出生地：山东省临沂市政治面貌：中共党员学习经历：2009.09-2013.06西南大学荣昌校区农学学士2013.09-2016.06军事医学科学院军事兽医研究所农学硕士个人荣誉：2015.12，在军事兽医研究所获得勃林格·殷格翰企业一等奖学金2016.01，在军事医学科学院获得数字化实验室技能比武三等奖攻读学位期间参与课题：科技基础性工作专项（项目编号：2013FY113600）个人成果：1BiaoHe,YunFeng,HailinZhang,LinXu,WeihongYang,YuzhenZhang,XingyuLi,ChangchunTu.FilovirusRNAinFruitBats,China.EmergingInfectiousDiseases,2015,21(9):1675.2LinXu,FuqiangZhang,WeihongYang,TingleiLu,BiaoHe,XingyuLi,TingsongHu,GangChen,YunFeng,QuanshuiFan,JiangFeng,HailinZhang,ChangchunTu.Detectionandcharacterizationofdiversealpha-andbetacoronavirusesfrombatsinChina.VirolSin,2016,31(1):69-77.3李兴宇，何彪，徐琳，涂长春.一株新型蝙蝠腺病毒基因分析.中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会;2015;中国山东济南.4李兴宇，陈刚，夏乐乐，周卫国，徐琳，余静，邱薇，张富强，范泉水，涂长春，胡挺松，何彪.云南一种新型蝙蝠博卡病毒的鉴定与分析.军事医学,2016,(3).81 5.李兴宇，徐琳，朱爱薇，江挺磊，谈之舟，蔡建秋，赵梓含，冯江，涂长春，何彪.东北三省蝙蝠病毒组学及新病毒鉴定，准备中。6.朱爱薇，米士江，江挺磊，李兴宇，徐琳，谈之舟，蔡建秋，赵梓含，冯江，涂长春，何彪.我国新型蝙蝠圆环病毒的分析与鉴定。投稿中7.LinXu,BiaoHe,XingyuLi,ChangchunTu.GeneticdiversityofbatrhabdovirusinChina.Inpreparing.82 致谢时间过得挺快，转眼间三年的硕士学习已经结束了。在这硕士研究生阶段，收获颇多，受益很大。首先，衷心的感谢我的硕士研究生导师——涂长春研究员。在两年半的实验室生活，涂老师把我从一名对科研实验不知所措的大学生培养到能够独立思考并能够完成相关实验的硕士研究生。从刚进实验室，涂老师就教会我学会学习，学习病毒学基础知识，打好病毒学基础；提供一种平台，从每次组会的演讲汇报中，培养我们演讲能力以及交流能力。使我的综合素质得到了提高。另外，涂老师平易近人，学识渊博，每次和涂老师交流，都会觉得受益匪浅，不仅仅是学术知识方面的，还有其他方面，比如为人处世等。在这里，再次向涂老师表示衷心感谢。衷心的感谢我们蝙蝠病原生态组课题负责人何彪博士，能够在我进入实验室后毫无实验基础的情况下，很有耐心地带着我从最基本的PCR开始做起，一步步的学习各种实验操作及理论知识。教会我如何学好做好我们蝙蝠病原学一些实验，如何设计实验，如何去解决试验出现的问题等。还有从最基本的生物信息学基础开始叫我，从起初设计引物，到后来一步步教会我做序列分析。从对蝙蝠病毒发掘毫无思路到能够鉴定多种新型蝙蝠病毒，一步步走来学会了注重细节、独立思考的能力。另外，在我们动物病毒学与人兽共患病防控实验室的两年半期间，何彪博士虽是留下做老师，但给我的感觉就是像一位大哥哥一样，照顾我们，留给我难以忘怀的美好回忆。在这里，再次向何彪博士及家人表示感激。特别感谢实验室的郭焕成老师、冯烨老师和刘艳老师。他们平易近人、乐于帮忙的态度，也很大程度上鼓舞了我前进的动力，顺利完成了硕士试验。还特别感谢实验室的龚文杰博士后、张岩博士后、曹永国博士后。平时，他们能够利用休息时间与我交流讨论，从他们身上学会了很多实验相关以及其他方面的知识；尤其是龚师兄，见多识广，博学多才，与师兄交流，收获很多。特别感谢信秀芹阿姨、王素珍阿姨，她们在平凡的岗位上，为我的实验能够顺利完成，提供了帮助。特别感谢我们蝙蝠病原生态小组的李勇博士后、徐琳博士、孟菲博士、夏乐乐硕士、蔡建秋硕士、刘东晓硕士、朱爱薇硕士、谈之舟硕士等人，我们相互交流相互帮助，使我很顺利地完成了硕士实验。还有我们实验室的谢金鑫博士、杨知博士、涂忠忠博士、千莎莎硕士、谢晓明硕士、张莉硕士、贾俊杰硕士、侯家麟硕士、张必凯硕士、罗庆华硕士、于明洋硕士、米士江硕士、苏南实验员、李83 文婧助理、许炜迪助理、刘婷芳助理和赵梓含助理，他们在我进入实验室后给予了我在实验上和生活上巨大的帮助。特别感谢在北京研究生学习期间的同学及老师。在军训期间，即便天气如何炎热，训练强度如何大，在我们学员一队四班的集体，能够相互扶持，相互鼓励最终完成了近三个星期的军训，使得我们自身的意志得到了锻炼以及也增进了同学间的友谊；在硕士研究生课程学习期间，我们学员一队的学生能够相互帮忙相互督促学习，顺利完成课程学习。也非常感谢大院的老师们，比如鲁显生老师、胡良平老师、刘红梅老师等，教我们的不仅仅是书本上的知识，更重要的是做最好的自己。进实验室后，这些同学又给予了信息交流，使我能够在长春这边也能够及时了解院相关信息。非常感谢科技处的陈威老师，不仅仅是传达院里、所里的通知，在生活上、学习上、工作上也给予我们帮助。记得刚来到所里的时候，威姐帮我们联系车去邮局收我们寄的包裹；记得威姐带领我们研究生去电影院去看电影；也记得威姐处于怀孕状态，带我们去新华社拍照片。在所里，我们有困难首先联系的就是威姐，她耐心给我们解答，在这里再次向陈威老师表示感谢。还有研究生同学王习文博士、迟航博士、闫飞虎硕士、张永武硕士、曹增国硕士等，使我在长春这边能够相互扶持共同完成硕士学习。同时，也特别感谢敬爱的黄伟老师。在西南大学荣昌校区期间，带领我学习最基本的试验技能，顺利完成本科的毕业试验。他那种对科学实验的严谨、执着、踏实、求实、创新的精神，深深影响着我，也为我研究生三年的学习给予强有力的动力。在黄老师的推荐下，能够有幸来到涂老师实验室进行研究生学习，顺利完成研究生学习。黄老师是我在兽医学习方面的领路人。特别感谢东北师范大学吉林省动物资源保护与利用重点实验室的老师们，为我们提供了东北三省地区的蝙蝠样品及鉴定工作；通过相互间的合作交流，使我也对东北师范大学也有了一种全新的了解。还特别感谢试剂公司，尤其是邵明富师兄，能够快速的将我所订购的试剂耗材及时送到我手上。另外，特别感谢我的家人，尤其是我年迈的父母。在城镇，他们这个岁数的人，都已经退休了，清享晚年，而我的父母，在家种着那三亩地，还依旧奔波在青岛，靠着摆地摊做生意，平时也不舍得花钱，就为了攒下钱供我读研究生。二十二年的求学生涯是靠我的父母亲倾其所有的支持走过来的，父母的恩情不是用言语就能表达的，永难忘。现如今，求学生涯暂以结束，仍无一事所成，有愧于父母。也非常感谢我的两位姐姐，不仅在生活上给予我帮助，还在背后默默的支持我读书。感谢武二丽硕士对我求学的鼓励与支持，正因为她的理解和包容才使84 得我能够全身心地投入到实验当中，并顺利完成硕士学习。特别感谢评阅本论文的专家学者能够在百忙之中抽出时间翻阅本论文。另外，还有很多我无法一一列举的师长及朋友给予我帮助与指导，再次表示衷心的感谢。本文得到了科技基础性工作专项（2013FY113600）的资助，在此一并表示感谢。最后，向所有关心我、帮助我的老师、师兄师姐、同学及师弟师妹们献上我诚挚的感谢，祝您们身体健康、工作顺利、天天有好心情！同时，也祝福我们军事医学科学院军事兽医研究所再创辉煌。李兴宇于长春·净月2016年5月9日85
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