微生物与发酵工程实验讲义.doc

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1、微生物与发酵工程实验济南大学化学与化工学院生物技术系2007年6月实验一细菌生长曲线的测定一、目的要求1．了解比光电比浊计数法原理2．学习掌握光电比浊计数法的操作方法3．通过细菌光密度的测量，了解细菌生长特征和规律，绘制生长曲线二、基本原理当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的通过量降低。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池准确测出。测定细菌浊度，光波通常选择400~700nm。光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。大多数细菌的繁殖速度很快。将一定的细菌转入新鲜

2、液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数生长期、稳定期/衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同培养条件下所绘制的生长曲线也不同。测定细菌的生长曲线，了解其生长规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。三、试剂和仪器1．菌种：放射状土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)2．培养基：蔗糖2%，酵母膏0.05%,尿素0.05%,NaCl0.01%,K2HPO40.5%，(N

3、H4)2SO40.02%，MgSO4•7H2O0.02%,pH7.03．仪器及其他用具755型分光光度计，振荡摇床，无菌吸管等。四、实验步骤1．接种用接种环接种一环细菌到盛有6ml液体培养基的试管中，30℃120rpm摇床振荡过夜培养。2．转接及取样将上述培养液接种到盛有54ml液体培养基的三角瓶内，30℃120rpm摇床振荡培养，每隔2小时用无菌吸管取样3ml测定比浊。3．OD600测定用未接种的液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。（注：这里以水为对照，测定空白培养基的OD值，最后把这个差减去即可。）4．结果分析及讨论一、实验结果1．

4、将测定的OD600填入下表：培养时间（hr）对照024681012光密度（OD600）2．绘制土壤杆菌的生长曲线以培养时间为横坐标，以OD600为纵坐标作图绘制土壤杆菌的生长曲线，找出生长时间及生长量的关系，区分土壤杆菌的延迟期、指数生长期、稳定期、衰亡期。思考题：1.光电比浊计数的原理是什么？2.如何区分土壤杆菌的延迟期、指数生长期、稳定期、衰亡期，并说出不同培养时期的培养特征。仪器规格数量仪器规格数量三角瓶125毫升1烧杯125-250毫升1250毫升1移液管5-10毫升7漏斗1量筒50毫升1比色管25毫升6试管202实验二纤维素酶的固体发酵一、实验目的

5、：1.学习固体发酵技术2.掌握发酵产物纤维素酶的提取及酶活测定二、实验原理纤维素是地球上数量最丰富的可再生生物质资源。全球每年光合作用的产物高达1500-2000亿吨，其中80%以上为木质纤维素类物质。自然界中，具有降解纤维素能力的微生物有近200种，其中丝状真菌是研究最多的纤维素降解类群。纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性

6、条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料羧甲基纤维素钠（CMC），麸皮2．主要仪器（1）752型分光光度计、（2）恒温水浴槽、（3）沸水浴锅、（4）电炉子、（5）剪刀、（6）万分之一分析天平、（7）恒温干燥箱、（8）冰箱、（9）试管架、（10）胶头滴管（11）具塞刻度试管20mL×24（12）移液管或加液器0.5mL×3；2mL×7（13）容量瓶100mL

7、×6；1000mL×3（14）量筒50mL×2；100mL×1；500mL×1（15）烧杯100mL×6；500mL×3；1000mL×13．试剂（均为分析纯）（1）浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12～15天）。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液准确称取DNS6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/LNaOH溶液262mL，再加到500mL含有18

8、5g酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O，MW=