家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展.pdf

《家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

南方农业学报JOURNALOFSOUTHERNAGRICULTUREISSN2095—1191；CODENNNXAABhttp：／／www．nfnyxb．anDOI：10．3969／j：issn．2095—1191．2013．5．854家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展覃吕高，屈达才+，李俊，徐周徐(广西大学农学院蚕学研究所，南宁530005)摘要：追踪研究蚕体内的抗家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus，BmNPV)基因与蛋白，了解家蚕抗BmNPv的机制，对减轻甚至解除血液型脓病、促进桑蚕产业发展具有重要意义。文章就家蚕抗BmNPV基因和蛋白的研究进展进行综述，提出今后对家蚕抗BmNPV的研究策略应是运用多种技术同时从DNA、RNA、蛋白质水平上进行研究，鉴定家蚕抗BmNPV基因或蛋白及其与抗BmNPV的相关性；再采用RNA干涉、转基因技术对家蚕进行基因操作，改变其对BmNPV的抵抗能力，确认这些基因、蛋白的抗病毒功能。另外，使用免疫组化、免疫共沉淀，ELISA等技术探索基因一蛋白、蛋白一蛋白问的相互作用，找到基因或蛋白的上、下游作用因子，解释清楚家蚕抗BmNPV的详细机制，为最终解除家蚕脓病危害、促进蚕业发展提供参考资料。关键词：家蚕；核型多角体病毒；基因；蛋白；研究进展中图分类号：$884．51文献标志码：A文章编号：2095—1191(2013)05—0854—05ResearchprogressinsilkwormgeneandproteinagainstBombyxmorinuclearpolyhedrosisvirusQINLti—gao，QUDa-cai+，LIJun，XUZhou-xu(InstituteofSericuhure，AgriculturalCollege，GuangxiUniversity，Nanning530005，China)Abstract：Anti—Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus(BmNPV)relatedgeneandproteininsilkworm(gom6yxmori)weretrackedandtheanti-BmNPVmechanismwasstudiedtoalleviateoreveneliminategrasserieandacceleratethedevelopmentofserieuhureindustry．Onthebasisofthepreviousresearchinanti—BmNPVgeneandprotein，itwasproposedthatregardinganti-BmNPVmechanismresearch，multipletechniquesshouldbeusedtoresearchsimultaneous—lyatDNA，RNAandproteinlevelSOastoidentifyanti—BmNPVgeneorprotein，andexpoundthecorrelationbetweengeneorproteinandanti—BmNPVphenotype．Subsequently，RNAinterferenceandtransgenictechnologyshouldbeusedtomanipulateonsilkwormgenetoimproveitsresistancetoBmNPV，andfurtherconfirmtheantiviralabilityofgeneandprotein．Inaddition，immunohistochemistry，CO—immunoprecipitationandELISAcouldbeusedtodetecttheinteractionofgene—proteinorprotein—protein，thenfindupstreamordownstreamfactors，andfinallyelucidatethedetailedmechanismofsilkwormresistancetoBmNPV．Thesestudieswillprovidereferencesforfindingthesolutiontograsserieandadvanc—ingthedevelopmentofsericuhureindustry．Keywords：silkworm；nuclearpolyhedrosisvirus；gene；protein；researchprogress0引吾自20世纪80年代以来，虽然日本、韩国等传统丝绸产业大国的桑蚕生产大幅度萎缩，但由于中国、印度、巴西和东西亚等国桑蚕产业的持续发展，世界蚕丝产业总体上不断增长。种桑养蚕现已成为中国、印度、泰国、越南等国共3000多万个家庭的主要经济来源(Zhoueta1．，2008；Xiaeta1．，2009)。其中，印度是近几十年来丝绸生产和国内消费增长最快的国家，蚕丝进口量位居世界第一；越南在低档蚕丝生产方面具有较大的优势；巴西则主要出口高档生丝(楼国庆，2005)。我国的桑蚕产业规模最大，蚕丝和绸缎产量分别占世界产量的70％和45％。2011年，我国桑园种植面积收稿日期：2012—10—25基金项目：国家星火计划项目(2011GA790001)；广西大学科研基金项目(XBZl20760)作者简介：*为通讯作者，屈达才(1961一)，博士，教授，主要从事蚕学、昆虫化学生态研究工作，E-mail：dacaiqu@gxu．edu．cn。覃吕高(1983一)，博士，主要从事家蚕抗核型多角体病毒分子生物学研究工作，E-mail：qinlvgao@163．COB 覃吕高等：家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展·855·82．73万ha，桑蚕种发种量1627万张，生丝产量10．8万t，真丝绸商品出口35．4亿美元，蚕农收入224．4亿元。广西是我国桑蚕产业规模最大的省(区)，据广西农业部门统计，2011年广西桑园种植面积16．77万ha、蚕茧产量29．6万t、蚕种产量437．8万张、规模企业生丝产量1．76万t、蚕农售茧收入102．96亿元，其中蚕茧产量连续7年全国第一，约占全国的38％。可见，桑蚕业在广西乃至全国农业经济中占有重要地位，但与此同时，家蚕病害的发生给桑蚕业带来极大困扰。据不完全统计，蚕病危害每年造成的损失约占总产量30％，严重制约了桑蚕产业的健康发展。其中，家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus，Bm．NPV)其引起的血液型脓病是最普遍、造成损失最大的蚕病(Ponnuveleta1．，2003)，因此，家蚕与BmNPV的相互作用关系成为近年来国际生物科学研究的热点和重点，旨在进一步追踪研究家蚕体内的抗BmN—PV基因和蛋白，了解家蚕抗BmNPV的机制，减轻甚至解除脓病对蚕业生产带来的危害。本文就家蚕抗Bm—NPV基因和蛋白的研究进展进行综述，以期为最终解除家蚕脓病危害、促进蚕业发展提供参考资料。1B瑚帅V的概况1．1BmNPV的生物学特性BmNPV为环状双链DNA病毒，是最早被发现的昆虫病毒(吕鸿声，1998)。它有两种病毒粒子表型：包涵体衍生病毒(Occlusion—derivedvirus，ODV)和芽生病毒(Buddedvirus，BV)。ODV和BV的囊膜是由不同途径所产生，其感染对象也有显著的组织特异性。ODV的囊膜与多角体蛋白具有亲和性，能特异感染家蚕中肠上皮的柱状细胞，即对家蚕中肠细胞有很高的感染性，但在体腔、血腔内的感染性较低。与ODV相反，BV的囊膜不感染家蚕中肠上皮细胞，但能与血腔、体腔内的许多种组织细胞发生特异性作用。因此，BV对体外培养细胞和体腔、血腔内各组织的感染性很高，但对家蚕中肠上皮细胞的感染性很低。除了对虫体内不同细胞类型和体外培养的家蚕细胞的感染力存在差异外，ODV和BV进入宿主细胞的方式也不同。ODV进入家蚕中肠上皮细胞主要是借助柱状细胞微绒毛与病毒囊膜的膜融合作用，而BV主要是通过吸附、胞饮作用进入对其敏感细胞。ODV和BV的不同入侵机制可能与病毒囊膜形态结构或化学组成不同有关。1．2BmNPV的感染途径BmNPV在自然界中以包涵体(Occlusionboay，OB)的形式存在，是一种多粒包埋型病毒粒子。存在于桑叶表面的OB粒子被家蚕幼虫吞食后，会在碱性的家蚕中肠液中释放出ODV，ODV通过围食膜后结合于中肠柱状上皮细胞外周的微绒毛上，然后病毒核衣壳进入细胞核内并进行病毒的复制和装配(Nishimuraeta1．，1994)。在感染早期，复制的核衣壳会从被感染细胞中释放出来，形成BV；至感染极晚期后，新形成的核衣壳在细胞核内形成有囊膜蛋白包被的ODV，然后多角体蛋白包裹ODV形成OB(LuandMiller，1996)。在家蚕死亡和液化后，释放在环境中的OB重新启动新一轮感染。1．3家蚕感染BmNPV后的症状及危害BmNPV感染家蚕后引发血液型脓病，一般简称脓病。这是一种急性传染病，在1～5龄蚕期均可发生。家蚕感染BmNPV发病后，躯体肿胀，体壁紧绷而光亮；体色乳白，如果刺破体壁可见乳白色的血淋巴流出。另外，病蚕狂燥不安，在蚕座四周到处爬行，因其体壁脆弱易破，病蚕爬过的地方常沾有从破裂体壁处流出的乳白色血淋巴(含有病毒粒子)。显微镜观察病蚕血淋巴可观察到大量多角体病毒粒子(陈世良，2008)。在生产上，BmNPV引发的血液型脓病是造成蚕业损失最严重的蚕病。该病传染力很强，发病后会迅速蔓延。在春、秋季养蚕期均有发生，尤其在养蚕户密集生产区的秋季蚕期发病率特别高，蚕病常呈大面积暴发，蚕茧产量严重降低(万成功等，2007)。2011年在云南各蚕区调查发现，楚雄、祥云蚕区家蚕血液型脓病发病率在7．o％左右，保山、巧家蚕区发病率在10．O％左右，发病最严重的是墨江蚕区，达12．8％(白兴荣等，2011o广西地处亚热带，闷热多湿的气候环境使得广西桑蚕更易暴发疾病，且呈发病季节长、发病面积广的特点。据不完全统计，广西每年因蚕病危害使蚕茧损失15％～20％。其中，血液型脓病发生最多、最普遍、造成损失最严重(闭立辉，2005)。2003年广西藤县桑蚕血液型脓病危害程度居广西第一，比其他病症造成的损失高3～1嘴(冯秀琼，2004o2家蚕对Bm]佃V抵抗性的遗传规律孟智兽(1982)研究表明，家蚕对BmNPV经口感染的抵抗性遗传方式受一对主效显性基因和若干微效基因调控。这种抵抗性的遗传父本大于母本，呈偏父遗传现象，杂种一代(F。)的抗病性表现出杂种优势，呈超显性现象。陈克平等(1996)研究了家蚕对BmN—PV的抵抗性及其遗传规律，结果表明：家蚕品系间对BmNPV的抗性存在差异，且幼虫期的攻毒发病率与全龄虫蛹率呈极显著负相关；抗性性状由两对以上基因调控，且至少有一对为主效基因；并再次证明有偏父遗传现象，其狭义遗传力为36．1％。钱荷英等(2006)采用几率值分析法和浓度(对数)一死亡率几率关系曲线法，研究家蚕对BmNPV经口感染的抵抗性遗传规律，结果显示：家蚕对BmNPV经口感染的抵抗性遗传方式受一对主效基因和若干微效基因控制，杂交后代(F。、F：)对于该病毒有偏父遗传现象。 ·856·南方农业学报3家蚕抗BmNPV基因的鉴定3．1Bms3a(RibosomalProteins3a)Xu等(2008)通过荧光差异显示技术分析了家蚕BmNPV抗性品系NB、感性品系306和近等基因系306NNZZ在添毒和未添毒处理时的基因表达情况，根据分析结果克隆出一条长702bp的cDNA片段，并用Northemblotting验证该片段的差异表达。该序列经同源性比较，发现其在数据库中的全长为827bp，其推导氨基酸序列与草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)、烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)中的对应蛋白的相似度很高。另外，该基因在家蚕感性和抗性品系，以及添毒和未添毒处理组间的表达均有差异。因此，推测它是一个与家蚕抗BmNPV相关的新基因，并定名为Bms3a基因。3．2son(SuppressorofProfilin)Xu等(2005)通过荧光差异显示技术鉴定获得一个在各品系家蚕中表达有差异的基因，命名为Sop2。该基因与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)、黑腹果蝇、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、小鼠、人(Homosapi．ells)的Sop2有很高的相似性，相似度分别为68．0％、65．0％、57．0％、56．2％和56．2％。Northemblotting和RT—PCR证明该基因与BmNPV的感染有关，在306、NB和BC8不同品系的中肠中均有表达，但加病毒后的表达量比未加病毒时要高，且在BmNPV侵染的感性306品系中肠的表达水平比未被BmNPV侵染的要高，表明Sop2可能是一个跟BmNPV敏感性相关的基因。3．3其他抗病毒基因Bao等(2009)鉴定了BmNPV侵染家蚕后的基因表达情况，结果表明，BmNPV能侵染高抗和高感家蚕的中肠，但在高抗品系中肠中的病毒增殖速度显著低于感性品系家蚕；为寻找抗BmNPV基因，又通过抑制消减杂交法构建这两个品系的cDNA文库，结果获得了62个表达差异性的基因，经荧光定量PCR进一步验证，发现其中8个基因很可能与抗病毒相关。此后，Bao等(2010)还将BmNPV接种于高抗品系KN和高感染品系306家蚕，然后以血淋巴和脂肪体为材料，用抑制消减杂交技术构建高抗品系和高感品系家蚕脂肪体、血淋巴的cDNA文库，共鉴定出96个表达有差异的基因，经荧光定量PCR进一步验证，发现其中的8个基因无论在脂肪体还是在血淋巴中，高抗品系的表达量比高感品系高，表明这些基因可能与家蚕抗BmNPV的性状有关。4家蚕抗BmNPV蛋白的鉴定4．1红色荧光蛋白(Redfluorescentprotein，RFP)Hayashiya等(1976)研究发现红色荧光蛋白(RFP)能使BmNPV失活。RFP是一种含有发光团的结合蛋白，有两个吸收峰(280和605nril)，在用280和550nnl的光激发时，可分别产生335和620nnq的荧光。RFP由3种组分构成：幼虫肠液中的一种蛋白质、叶绿素一仅(Chlorophyl．01)及来自叶绿体的一种碱性蛋白质。生理学研究发现，RFP能灭活BmNPV和GalleriaNPV(Isomuraeta1．，1992)，但RFP抗病毒的机理尚未清楚，有研究认为主要是通过毁坏BmNPV的核衣壳或阻止BmNPV复制，使其最终伴随粪便排出(Hirakieta1．，1997)。4．2Lipases一1Ponnuvel等(2003)在家蚕幼虫的消化液中发现一种具有抗BmNPV功能的蛋白，经N一端测序后，推算其分子量为28．974kDa，氨基酸序列与果蝇脂酶(Dlip一1)、人脂酶的相似性较高。该蛋白还含有脂酶家族活性位点的保守氨基酸残基，说明其具有脂酶的生物催化活性，因此命名为Lipases一1。Northernblotting分析结果表明，该基因仅在家蚕中肠组织中表达，在病毒感染早期，该蛋白对BmNPV侵染起潜在的生理障碍作用，但其抑制机理至今仍未清楚(Ponnuveleta1．，2003)。此外，姚慧鹏等(2008)也从野桑蚕幼虫中肠细胞克隆获得脂肪酶基因，发现该基因仅在中肠组织中表达，且在幼虫期表达更高，在眠期和熟蚕期几乎没有表达。对体外重组表达的脂肪酶进行抗病毒检测，发现它能有效抵制BmNPV对家蚕的感染，进一步说明脂肪酶具有抗病毒功能。4．3丝氨酸蛋白酶家蚕先天免疫可能有更多的相关抗病毒蛋白参与。Nakazawa等(2004)从家蚕消化液分离获得另外一种有抗BmNPV．ODV活性的蛋白。N一端测序发现其N一端部分的氨基酸序列为NH：一ⅣGGSAANAGAHPHLAGLVI，与已报道的家蚕丝氨酸蛋白酶有94％的相似性，故将其命名为家蚕丝氨酸蛋白酶一2(BmSP一2)。在家蚕EST数据库中搜索该序列的同源序列，发现其与4个来自家蚕的EST克隆(编号为m90688、mgl03、m9564与m9994)序列相似，且4个序列的蛋白氨基酸序列高度相似，因此推测这些蛋白是异构体。在4个EST克隆中，mgl03克隆编码284个氨基酸残基，产生成熟蛋白时其N一端50个氨基酸残基被切除，分子量预测为24．276kDa，与LC．Ms测定的蛋白分子量几乎相同；m90688、m9564与m9994克隆推测的成熟蛋白分子量与BmSP一2差异较大，因此推测BmsP一2是mgl03片段编码肽链后修饰而成。BmSP一2基因只在家蚕中肠表达，在其他组织(脂肪体、血细胞、马氏管、丝腺及气管)未能检测到；Northernblotting分析表明，BmSP一2基因在大眠期及熟蚕期(5龄第7d化蛹之前)均不表达。Qin等(2012)以BmNPV抗性品系NB、感性品系306及其杂交F，代(抗性)为材料，对5龄起蚕接种病毒24h后，用蛋白质组学方法和Westernblotting分析研究蛋白在抗性品系和感性品系间表达的情况，结果发现丝氨酸蛋白酶一4和半胱天冬酶．1只在抗性家蚕品系中表达，在感性品系中不表达，表明丝氨酸蛋白酶很 覃吕高等：家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展·857·可能与家蚕抗病毒性状有关。同样，半胱天冬酶一l也可能参与家蚕的抗病毒作用。4．4NADH氧化还原酶类似蛋白Uchida等(1984)从家蚕的消化液中分离出一种蛋白，分子量27～28kDa，沉降系数2．61S。该蛋白能在体外使BmNPV失活，电子显微镜观察发现其外膜表面有非结晶物质。Selot等(2007)报导在家蚕中肠液中有一个26．5kDa的蛋白具有广谱抗病毒活性，包括抗BmNPV；经鉴定，该蛋白为可溶性的NADH氧化还原酶类似蛋白(BmNOX)。研究还发现，在Mytilusgalloprovincialis、Drosophilame儿mogas铆幼虫和GaJje一施melonella等物种中，BmNOX与虫体对不利环境的抵抗作用之间关系紧密。因此推测，BmNOX除在家蚕抗BmNPV中起重要作用外，还在其他昆虫和动物体内毁坏病毒粒子方面发挥作用。4．5其他抗BmNPV蛋白Liu等(2010a)用抗性家蚕品种NB和感性品种306构建出了近等基因系BC9，然后用二维电泳结合质谱的方法鉴定不同品系家蚕中表达有差异的蛋白质，结果表明，13-N．乙酰葡糖胺糖苷酶和氨基酰化酶只在抗病毒品种血淋巴中高度表达，在感性品种中表达量较低，表明这两种蛋白很可能与家蚕抗病毒有关。另外，还测定了这两个酶的活性，发现这两种酶在抗病毒品系NB和BC9中的活性较高，在感病毒品系306中的活性相对较低(Liueta1．，2010a)，进而推测在抗性家蚕的血淋巴中，过量表达的13-N．乙酰氨基葡萄糖苷酶可能会干扰细胞膜上GP64蛋白的N连接聚糖，从而阻止了启动二次感染关键蛋白的功能，减少了有感染力病毒粒子的产生。Liu等(2010b)还对比了3个品系家蚕(NB、306、BC9))J旨肪体蛋白质组的差异，结果表明，精氨酸激酶、多聚蛋白质和两个未知蛋白在抗性和感性品种中存在差异表达，多聚蛋白质与整合酶有相似的功能，精氨酸激酶及其中一个未知蛋白可能与能量代谢有关，而另一个未知蛋白功能尚未清楚。5展望桑蚕产业为中国乃至世界经济的发展作出J，重要贡献，但家蚕病害，特别是血液型脓病的发生严重制约了桑蚕产业发展。至今，已分别从DNA、RNA、蛋白质水平上对家蚕和BmNPV进行研究，鉴定出了多个可能起抗病毒作用的基因和蛋白质，为最终解释家蚕抗BmNPV机制提供了重要的资料。但这些研究大多是分开对DNA、RNA或蛋白质进行研究，未能同时从DNA、RNA和蛋白质水平上进行探讨。有的使用基因组学、转录组学技术对DNA、RNA进行研究，寻找与抗BmNPV相关的基因；有的用蛋白组学技术鉴定与抗BmNPV有关的蛋白质；有的用荧光定量PCR对可能抗BmNPV的蛋白作初步验证；有的用纯化好的蛋白喂食家蚕，发现家蚕的抗病毒能力增强，即证明该蛋白具有抗病毒功能。此外，研究鉴定出来的抗病毒基因或蛋白未进行基因一蛋白或蛋白一蛋白的相互作用试验，没有找到与抗病毒因子相互作用的上、下游因子，因此很难详细、清晰地解释家蚕抗病毒的机理。RNA干涉、转基因技术是最具说服力的验证基因(或基因对应的蛋白)抗病毒功能的试验手段，如果能通过这些方法调控相关基因在家蚕体内的表达，使抗病毒家蚕变成感病毒家蚕，或感病毒家蚕变成抗病毒家蚕，即可有力地证明该基因(或对应的蛋白)必定是抗病毒因子。互Illto等(2008)发现／／Sd一2基因缺失6kb的片段时家蚕对2型浓核病毒(BmDNV一2)具有抵抗性，并通过转基因技术对nsd-2基因表达进行调控，使抗性家蚕变成感性，感性家蚕变成抗性，进一步确定nsd-2基因对家蚕抗一感BmDNV一2的决定性作用。因此，今后对家蚕抗BmNPV的研究策略应是运用多种技术同时从DNA、RNA、蛋白质水平上进行研究，鉴定家蚕抗BmNPV基因或蛋白及其与抗BmNPV的相关性；再采用RNA干涉、转基因技术对家蚕进行基因操作，改变其对BmNPV的抵抗能力，确认这些基因、蛋白的抗病毒功能。另外，使用免疫组化、免疫共沉淀，ELISA等技术探索基因一蛋白、蛋白一蛋白间的相互作用，找到基因或蛋白的上、下游作用因子，解释清楚家蚕抗Bm．NPV的详细机制。参考文献：白兴荣，亚江，黄平．2011．云南省家蚕血液型脓病的危害与流行分析EJ]．云南农业科技，(4)：31—32．BaiXR，YaJ，HuangP．2011．HazardsandpopularanalysisofsilkwormnucleopolyhedomsisinYunnanProvince[J]．Yun—nanA知culturalScienceandTechnology，(4)：31—32．闭立辉．2005．广西当前主要蚕病与防治[J]．广西蚕业，42(4)：10—14．BiLH．2005．CurrentmainsilkwormdiseasesinGuangxianditscontrollJJ．GuangxiSericuhure，42(4)：10—14．陈世良．2008．家蚕血液型脓病的症状、发生原因及防治措施[J]．云南农业科技，(s2)：90—91．ChenSL．2008．Symptoms，causesandpreventionmeasuresofsilkwormnucleopolyhedoIDsis[J]．YunnanAgriculturalSci—enceandTechnology．(S2)：90—91．陈克平，林昌麒，姚勤．1996．家蚕对核型多角体病的抗性及遗传规律的研究[J]．蚕业科学，22(3)：160—164．ChenKP，LinCQ，YaoQ．1996．StudiesontheresistancetoNPVanditshereditaryregularityinthesilkworm(BombyxmoriL．)[JJ．ActaSericologicaSinica，22(3)：160—164．冯秀琼．2004．夏秋季蚕病的发生情况与防治[J]广西蚕业，41(2)：2l一23．FengXQ．2004．Silkwormdiseaseoccurrenceantitsproventioninsummerandautumn【Jj．GuangxiSericuhure，41(2)：21—23．楼国庆．2005．世界丝绸业发展规律与我国策略的研究[D]．杭州：浙江大学：5-6．I力uGQ．2005．StudyondevelopinglawofworldsilkindustryandChinesestrategylDJ．Hangzhou：ZhejiangUniversity：5-6．吕鸿声．1998．昆虫病毒分子生物学[M]．北京：中国农业科技 ·858·南方农业学报出版社：152—156．LnHs．1998．M01ecularBiologyofInsectVirus[M]．Beijing：ChineseAgriculturalScientificandTechnicalPress：152一156．孟智兽．1982．家蚕对核型多角体病毒病抵抗性遗传规律的研究[J]．蚕业科学，8(8)：133—138．MengZQ．1982．Geneticlawofsilkwo珊resistancetonucle—opolyhedomsis【J]．ActaSericologicaSinica，8(8)：133—138．钱荷英，徐安英，林昌麒，赵云坡，孙平江，张月华．2006．家蚕对核型多角体病毒病抵抗性及遗传规律的研究[J]．河北农业大学学报，29(4)：77—79．QianHY，XuAY，LinCQ，ZhaoYP，SunPJ，zhangYH．2006．Studiesontheresistancetonuclearpolvhedrosisvims(NPV)anditsinheritancelawinsilkwo珊Bo埘6yx埘。一lJJ．JoumalofAg—cultumlUniversifyofHebei，29(4)：77—79．万成功，周义奎，谢同建．2007．家蚕病毒病多发原因与对策[J]．蚕桑茶叶通讯，(6)：17—18．WanCG，ZhouYK，XieTJ．2007．Epidemicreasonofsilk—wo丌Ilvimsanditscontmlmeasures[J]．NewsletterofSeri—cultureand‘rea，(6)：17—18．姚慧鹏，何芳青，郭爱芹，曹翠平，鲁兴萌，吴小锋．2006．中国野桑蚕抗病毒蛋白基因(“pase)的克隆与活性鉴定[J]．蚕业科学，34(3)：466—471．YaoHP，HeFQ，GuoAQ，CaoCP，LuXM，WuXF．2006．Cloningofanantivimlproteingene(Ljpase)f而mChinese、订ldsilkwo珊，BbJ玎6yxman(妇一naMooreanditsbioactivitvassavlJJ．ScienceofSe—culture，34(3)：466—471．BaoYY，LvZY，LiuZB，XueJ，XuYP，ZhangCX．2010．ComparativeanalvsisofBombyx脚。一nucleopolvhedmvimsresponsivegenesinfatbodvandhaemocvteofB．珊。订re—sistantandsusceptiblestminsJI．InsectMolecularBiolo一对，19(3)：347—358．BaoYY，7I、angXD，LvZY，WangXY，TianCH，XuYP，ZhangCX．2009．GeneexpressionpmfilingofresistantandsusceptibleBom匆xmodstrainsrevealsnucleopolyhe—drovimsassociatedvariationsinhostgenen．anscriptlevels[J]．Genomics，94(2)：138—145．HayashiyaK，UcmdaU，NishidaJ．1976．Compadsonofanti—vi—ralactivitiesofthesilkwo肌lanraerearedinlightandindarknessinrelationtothefomlationofrednuorescentDID—tein(RPF)lJj．JapaneseJoumalofAppliedEntomologyandZoolo盯，20(3)：139—143．HirakiA，YukawaM，KimJ，UedaS．1997．AntiviraIsubstancef而msilkwomfaeces：Durificationanditschemicalcharac—terizatjon[J]．Biologjcal&PharmaceuticalBulletin，20(5)：547—555．IsomumT，Tamiva—KoizumiK，SuzukiM，YoshidaS，TaniguchiM，MatsuyamaM，IshigakiT，SakumaS，TakahashiM．1992．RFPisaDNAbindingpmteinassociatedwiththenuclearmatrix[J]．NucleicAcidsResearch，20(20)：5305—5310．ItoK，KidokoroK，SezutsuH，NohataJ，YamamotoK，KobayashiI，UchinoK，KalvebiA，EguchiR，HamW，TamuraT，Kat—sumaS．ShimadaT．MitaK．Kadono一0kudaK．2008．Dele—tionofageneencodinganaminoacidtransporterinthemidgutmembranecausesresislancetoaBo脚6yxparvo—likevims[J]．PmceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，105(21)：7523—7527．LiuX，YaoQ，WangY，ChenK．2010a．Proteomicanalysisofnucleopolvhedmvimsinf色ctionresistanceinthesilkwo瑚，曰。珊6，Ⅸ册(疵(Lepidoptera：Bombycidae)[J]．JoumaIofIn—vertebratePatholo盯，105(1)：84—90．LiuxY，ChenKP，YaoQ，xiaHC．2010b．Pmteomicanalysisofdif艳rentiallyexpressedpmteinsinvolvedinBmNPVre—sistanceinthefatbodyofsilkwom，Bom_b_yx埘od[J]．ZeitschriftFurNatuIforschungC—aJoumalofBiosciences，65(11)：713—718．LuA，MillerLK．1996．GeneralionofrecombinaIltbaculovims—esbydirectcloning[J]．BioTechniques，21(1)：63—68．NakazawaH，7I、uneishiE，PonnuvelKM，FumkawaS，AsaokaA，TanakaH，IshibashiJ，YamakawaM，2004．AntiviraIac—tiVityofaserineproteasef南mthedigestivejuiceofBo珊一与p脚D打lan，aeagains￡nucleop01yhedrovjms[J]．Virology，321(1)：154一162．NishimuraT，FavreD，Dnrrenbe艰erM，MichelMR，Ichih啪I。KobletH．1994．NuclearexDonofrecombinantbaculovimsnucleocapsidsthroughsmallporeornuclear—pore—likestIuctureinSf9cellslJj．0kaiimasFbliaAnatomicaJapon—ica，71(2—3)：83—97．PonnuvelKM，NakazawaH，Furl】kawaS，AsaokaA，IshibashiJ，TanakaH，YamakawaM．2003．AliDaseisolatedfromthesilkwo咖Bom6yx埘。打showsantiviralactivitvagainstnu—cIeopolyhedmvimslJj．JoumalofVimIog)r，77(19)：10725—10729．QinL，xjaH，ShiH，zhouY，ChenL，YaoQ，Liux，FengF，YuanY，ChenK．2012．Comparativepmteomicanalvsisre—vealsthatcaspase一1andsennepIDteasemavbeinvolvedinsilkwoⅡnresistancetoBo埘Jbyx埘。打nuclearpolvhedrosisvimslJj．JoumalofProteomics，75(12)：3630—3638．SelotR，KumarV，ShuklaS，ChandmkuntalK，BrahmaraiuM，DandinSB．LaloravaM．KumarPG．2007．IdentmcationofasolubleNADPHoxidoreducIase(BmNOX)withantiviralactivitiesinthegIltjuiceofBom匆xmodlJ]．Bioscience，Biotechnolo#ⅣandBiochemistIy，71(1)：200～205．UchidaY，KawamotoF，HimenoM，HavashivaK．I984．Avims—inactivatingpIDteinisolatedfromthedigestivejuiceofthesilkwo丌n，Bom6蹦脚。打lJj．JoumalofInvertebratePathol—o盯，43(2)：182一189．XiaQ，GuoY，ZhangZ，LiD，XuanZ，LiZ，DaiF，IjY，ChengD，LiR，ChengT，JiangT，BecquetC，XuX，LiuC，ZhaX，FanW，LinY，ShenY，JiangL，JensenJ，HeUmannI，TangS，ZhaoP，XuH，YuC，ZhangG，LiJ，CaoJ，LiuS，HeN，ZhouY，LiuH，ZhaoJ，YeC，DuZ，PanG，ZhaoA，ShaoH，ZengW，WuP，LiC，PanM，YinX，WangJ，ZhengH，WangW，ZhangX，LiS，YangH，LuC，NielsenR，ZhouZ，XiangZ，WangJ．2009．Completeresequencingof40genomesrevealsdomesticationeventsandgenesinsilk—woⅡ11(B伽_byx)lJJ．Science，326(5951)：433—436．XuJP，ChenKP，ⅡuMH，YaoQ，GaoCT，ZhaoY．2008．I—dentificationandcharacterizationofBms3ainBo埘b’，x脚odL．1Jj．AmcanJoumalofBiotechnolo#拶，7(19)：3424—3430．XuJP，ChenKP，YaoQ，LiuMH，GaoGT，ZhaoY．2005．I—dentificationandcharacterizationofanNPVinf色ction—re—lated{筘neBmsop2；n．B。埘6yx埘n卉L．【Jj．JoumalofAp—pliedEntomolo#w，129(8)：425—431．ZhouZH，YangHJ，ChenM，IDuCF，ZhangYZ，ChenKP，WangY，YuML，YuF，LiJY，ZhongBX．2008．Compar—ativepmteomicanalvsisbetweenthedomesticatedsilkwo咖(上bm6yx脚。矗)rearedonfkshmulberryleavesandonar—tificialdietlJj．JoumalofPrDteomeResearch，7(12)：5103—51】1．(责任编辑兰宗宝)