猪伪狂犬病毒野毒株SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR诊断试剂盒的研制-论文.pdf

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1、河南农业科学，2014，43(6)：128—131，144JournalofHenanAgriculturalSciences猪伪狂犬病毒野毒株SYBRGreenI实时荧光定量PCR诊断试剂盒的研制余波，周思旋，谭诗文，徐景峨，史开志，杨莉(贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳550005)摘要：根据GenBank中猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因序列设计特异性的j1物，PER扩增获得PRVgE基因片段，构建重组质粒pMD18一T—gE，作为阳性标准品。对SYBRGreenI实时荧光定量PCR反应条件进行优化，建立猪PRVSYBRGreenI实时荧光定量PC

2、R诊断方法，研制诊断试剂盒。扩增产物的熔解曲线分析结果显示只出现单特异峰，无引物二聚体，对猪圆环病毒(PCV～2)、猪细小病毒(PPV)、PRV(gE基因缺失株)、猪源E．coli、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)均无阳性信号扩增，且重复性好，灵敏度可迭2．3×10拷贝／L。结果表明，研制的PRV野毒株SYBRGreen工实时荧光定量PCR试剂盒特异、灵敏、快速、重复性好，适于伪狂犬病毒I】盏床样品的检测。关键词：猪伪狂犬病毒；野毒株；gE基因；荧光定量PCR；诊断试剂盒中图分类号：$854．43文献标志码：A文章编号：

3、1004—3268(2014)06—0128—05DevelopmentofSYBRGreen工Real—timeQuantitativePCRKitforDetectionofPRVWild—typeStrainsYUBo，ZH()USi—xuan，TANShi—wen，XUJing—e，SHIKai—zhi，YANGLi(GuizhouInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，Guiyang550005，China)Abstract：Accordingtothegenesequencesofg

4、EgeneofPRVinGenBank，onepairsofspecificprimerwasdesignedforamplifyingthespecificfragmentsofgEgene．ThengEgeneofPRVamplifiedbyPCRwasclonedintopMD18一Tvectoranditwasusedaspositivestandard．Afteroptimizationofannealingtemperatureandprimersconcentrations，aSYBRGreenIreal—timequantitativ

5、ePCRkitwasdevelopedfordetectionofPRVwild-typestrains．ThemeltingcurveanalysisusingSYBRGreenIdyeshowedonespecificpeak，andprimer-dimerspeakwasnotobserved．NofragmentwasamplifiedfromPRVstrainsdepletedofgEgene，PPV，PCV-2，Escherichiacoli，CSFV，PRRSVbytheSYBRGreenIreal—timequantitativePC

6、R．ThePCRkitwashighlysensitivein2．3×10copies／／~IDNA．TheresultsrevealedthatthePCRkitwassensitive，specificanditcouldbeusedtodetectPRVwild-typestrainsinclinicalsamples．Keywords：PRV；wild-typestrains；gE；real-timequantitativePCR；diagnostickit伪狂犬病毒(PRV)能引起猪、牛、羊、犬等多木乃伊胎，仔猪出现神经症状，并可导致仔猪免

7、疫种家畜发病，猪是该病毒的贮存宿主和传染源。抑制，耐过仔猪则生长缓慢，成年猪多呈隐形感猪伪狂犬病是由PRV引起的一种危害严重的传染引，给养猪业造成了巨大的经济损失。对PRV染病，感染PRV后可造成妊娠母猪流产、死胎和的快速、准确诊断是防治该病的关键。目前，猪伪收稿日期：2014一O2—2O基金项目：贵州省科技厅农业攻关项目(E2o1013085)；贵州省畜禽健康养殖技术创新能力建设项目(~201014004)作者简介：余波(1981一)，男，四川邻水人，副研究员，硕士．主要从事兽医分子生物学研究。E—mail：yubonky@163．corn*通讯作

8、者：谭诗文(1956一)，男，贵州天柱人，研究员，本科，主要从事兽医分子生物学研究。E—mail：tswle