硫普罗宁对乙醇所致IMR-32人神经母细胞瘤细胞氧化损伤的作用机制.pdf

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1、·l846·广东医学2015年6月第36卷第l2期GuangdongMedicalJournalJun．2015，Vo1．36，No．12硫普罗宁对乙醇所致IMR一32人神经母细胞瘤细胞氧化损伤的作用机制王娟。吉红亮河南中医学院第二临床医学院急诊科(郑州450002)；郑州郑荣医院普内科(郑卅i450053)【摘要】目的探讨乙醇所致IMR一32人神经母细胞瘤细胞氧化损伤的作用机制，以及硫普罗宁对其诱导的氧化损伤的影响。方法实验设置对照组(不加药)、乙醇小剂量(200mmol／L)组、中剂量(400mmol／L)组、大剂量(800mmoL／L)组，选取中剂量组同时

2、加入不同浓度的CYP2EI特异性抑制剂二烯丙基硫醚(1、4、8mmol／L)，或不同浓度的硫普罗宁(0．02、0．2、2mmol／L)，分别处理细胞24h。采用生化方法检测乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)，共聚焦显微镜检测活性氧(ROS)和线粒体膜电位，免疫荧光检测CY1)2El蛋白，Westernblot检测总ERK1／2蛋白水平和磷酸化水平。结果经过低、中、高剂量乙醇处理后，LDH活力分别较对照组升高，SOD活力下降与中剂量组比较，加入低、中、高剂量二丙烯基硫醚抑制剂，LDH活力降低，且SOD活力升高；合用低、中、高剂量硫普罗宁后，LDH活力分

3、别降低，且SOD活力升高。与对照组相比，经过低、中、高剂量的二丙烯基硫醚和硫普罗宁单独处理，细胞培养基LDH活力和SOD活力均没有变化(P>0．05)。低、中、高剂量乙醇处理组CYP2El蛋白水平较对照组升高，0．2IllI1]O]／L硫普罗宁舍用400mmol／L乙醇降低CYP2EI的表达7％(P<0．01)。经过低、中、高剂量乙醇处理后，ROS生成量较对照组升高。与乙醇(400mmol／L)组比较，加入低、中、高剂量二丙烯基硫醚抑制剂后，ROS含量下降；加入低、中、高剂量硫普罗宁，ROS含量下降。经过低、中、高剂量乙醇处理后，线粒体膜电位荧光强度较对照组升高

4、。与乙醇(400mmol／L)组比较，加入低、中、高剂量二丙烯基硫醚抑制剂后，线粒体膜电位荧光降低；加入低、中、高剂量硫普罗宁，线粒体膜电位荧光降低。低、中、高剂量乙醇处理组ERK蛋白总量不变，P—ERK蛋白表达下降。与乙醇(400mmoL／L)组比较，4mmol／L二丙烯基硫醚增加P—ERK1／2蛋白量32％(P<0．01)；0．2mmo1／L硫普罗宁增加P—ERK1／2蛋白量33％(P<0．(J1)。结论乙醇可通过诱导CYP2E1表达，使得ROS生成量增加，并下调磷酸化ERK1／2蛋白，降低线粒体膜电位，导致神经细胞损伤；CYP2E1抑制剂二丙烯基硫醚和硫普

5、罗宁可抑制CYP2E1表达或抑制其活性，有效减少ROS产生，上调ERKI／2蛋白磷酸化水平，稳定线粒体，保护乙醇损伤的神经细胞。【关键词】乙醇；神经细胞；细胞色素P4502E1；自由基；硫普罗宁人CYP2E1约占肝脏的总CYP的6％，参与2％已MEM培养基，胰酶(含EDTA)(杭州吉诺生物医药技上市药物的代谢。CYP2EI代谢各种小分子量、疏水术有限公司)；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒，超氧化性物质，如药物氯唑沙宗和内源性底物包括丙酮和脂物歧化酶(SOD)测定试剂盒购自南京建成生物工程研肪酸如亚油酸和花生四烯酸等⋯。CYP2E1具有较高究所；吐温一80(湖北大

6、学化工厂)；冰乙酸(郑州市化的NADPH氧化活性，代谢过程中会产生活性氧(reac．学试剂三厂)；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(上海市新华tireoxygenspecies，ROS)，如羟自由基、超氧阴离子和化工厂)；氯化钠(开封市化学试剂二厂)；ERK1／2和P过氧化氢等，并且ROS的产生并不依赖配体的存—ERK1／2抗体购自CellSignaling公司；I3一actin抗体在。CYP2E1在神经毒理方面的作用与其介导的自购自Santa公司。由基生成有密切的联系。乙醇是CYF2E1的经典底物主要仪器：CO，恒温培养箱(美国ThermoFisher及诱导剂。IMR一

7、32细胞来源于人神经母细胞瘤细胞Scientific)；倒置显微镜(日本Olympus)；超净工作台系，可表达CYP2E1，也可用于乙醇的靶位——GABAa(苏州净化设备厂)；立式压力蒸汽灭菌器(上海申安受体和烟碱型乙酰胆碱受体的研究。2014年1医疗器械厂)；UV一1601紫外可见分光光度(日本岛月，本研究采用IMR一32细胞，探讨乙醇所致神经细津)；电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；胞氧化损伤的作用机制，以及硫普罗宁(TPN)对其诱SHZ一82型水浴恒温振荡器(江苏太仓市实验设备导的氧化损伤的影响。厂)；一80超低温冰箱(海尔集团)；激光共聚焦显微1

8、材料与方法成像系统(德国